mikrobiologiabio
mikrobiologiabio.blog.interia.pl
Notki
6 2012-06-20
WYKŁAD 10.05 – Otrzymywanie preparatów enzymatycznych:

Spośród ponad 150 enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym największe znaczenie mają enzymy z klasy hydrolaz (amylazy, proteazy, lipazy, poligalakturonany, alulazy), których zawartość przekracza 80% wartości całej produkcji enzymów.
Przypuszcza się zę w przyrodzie występuje ok. 25 tys. enzymów, z który 2100 oficjalnie zarejestrowano, jedynie niewielka ich część znalazła zastosowanie w przemyśle, niewiele ponad 20, w medycynie 22 i 19 w analityce. Spośród im mobilizowanych form biokatalizatorów zastosowanie znalazło nie więcej niż 10 enzymów.
Mikroorganizmy są podstawowym źródłem enzymów, a wydajna produkcja określonych enzymów zalezy przede wszystkim od predyspozycji wyselekcjonowanych szczepów.
Źródłem enzymów są grzyby strzępkowe (Aspergillus, Penicillium, Mucor, trichothelium), bakterie (Bacillus), drożdże (Saccharomyces) i promieniowce. Syntetyzowane enzymy mogą powstawać w komórkach (endoenzymy) lub są wydzielane na zewnątrz (egzoenzymy). W pierwszym przypadku uzyskiwane są z biomasy a w drugim z filtratu pohodowlanego.
Produkcja preparatów enzymatycznych
• polega na hodowaniu wyselekcjonowanych odpowiednich, aktywnych szczepów i następnie na wydzielaniu enzymów ze środowiska, ich oczyszczaniu i zagęszczaniu.
• metoda powierzchniowa- podłoże stale w płytkach, tacach, grubej warstwie lub fermentorach
• metoda hodowli wgłębnej
Procesy jednostkowe w produkcji enzymów
• otrzymywanie biomasy drobnoustrojów lub cieczy pofermentacyjnej o dużej zawartości określonych enzymów jedną z metod: powierzchniową lub wgłębną (okresową, półciągłą, ciągłą) w ciekłej pożywce oraz w stałym podłożu (SSF).
• wydzielanie enzymów w postaci kompleksów lub pojedynczych enzymów.
Endoenzymy- oddzielane od niebiałkowych związków komórkowych i od białek nieenzymatycznych, które oddziałują na ich aktywność niektóre z nich są stosowane z pominięciem izolacji z komórek i oczyszczania. Inaktywacja ogrzewanie, proteoliza, pH środowiska, oksydacja, zw. denaturujące.
• proteoliza ma miejsce we wczesnych etapach oczyszczania enzymu (ekstrakcji i oczyszczania)
• preparatu enzymatyczne stosowane w przemyśle są oczyszczane w ograniczonym stopniu, co jest możliwe dzięki optymalizacji warunków biosyntezy lub częściej doborami wydajnych mutantów otrzymanych matodą inżynierii genetycznej. zawartość enzymu w nieoczyszczonym preparacie powinna przekraczać 10%.
• niektóre enzymy są stosowane w postaci biomasy (endo) lub skoncentrowanej pożywki hodowlanej (egzo) z dodatkami stabilizującymi aktywność.
• najczęściej preparaty enzymatyczne są produkowane w postaci zagęszczonych roztworów lub proszku.
• początkowe operacje wydzielania i oczyszczania obejmują filtrację, wirowania (do gromadzenia biomasy)
Koagulanty i flokulanty poprawiają skuteczność wirowania poprzez eliminację ładunków elektrycznych, np. wskutek zmiany pH, lub wiązanie przeciwnie naładowanych cząstek.
• endoenzymy są uwalniane z komórek po dezintegracji mechanicznej, rozcieraniu z piaskiem kwarcowym lub ziemią okrzemkową, bądź ultradźwiękami. Środowisko zapewniające max stabilności enzymu.
• niemechaniczne metody: szok osmotyczny, zamrażanie- rozmrażanie, zimny szok, osuszenie, liza chemiczna lub enzymatyczna (lizozym), celuloza, proteaza lub autoliza.
Autoliza jest szeroko stosowana mimo długotrwałości i potencjalnego zagrożenia zakażeniami mikrobiologicznymi. Liza enzymatyczna najczęściej lizozymem lub enzymami.
• Liza roztworami kwasów i zasad, rozpuszczalnikami organicznymi oraz surfaktantami (np. Triton X-100) jest przydatna do uwalniania enzymów związanych z błoną komórkową. Są teo jednak związki kosztowne i trudne do usunięcia z produktu końcowego.
• Bardzo często róże metody są stosowane łącznie np. autolizę poprzedza rozdrobnienie lub zniszczenia struktury kom., działanie ultradźwięków lub hydrolaz.
• Preparat enzymatyczne są wydzielone acetonem (nie tracą aktywności przez długi czas i są przydatne do produkcji enzymów o dużej czystości)
• Większe trudności sprawia ich wydzielenie ze struktur kom. np. jąder
• Ekstrakcja jest prowadzona nadmiarem rozpuszczalnika (od 2 do 10 obj. na jednostkę masy biomasy), długotrwale w niskiej temp. (2-5°C) lub przez 2-3 godz. w 30-45°C. niepożądane aktywności enzymatyczne są usuwane przez ogrzewanie w warunkach zależnych od ich możliwości na denaturację i precypitację
• Usunięcie lipidów związanych wymaga ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi (mieszaniną etanolu i eteru, eterem) w 50-60°C, po zamrożeniu lub termicznym denaturowaniu biomasy. Obecne w preparatach endoenzymów kwasy nukleinowe zwiększają lepkość środowiska i dlatego SA usuwane przez strącanie białkiem o zasadowych właściwościach tzn. zawierających duża liczbę grup z ładunkiem dodatnim (arginina, lizyna) np. protaniną, bądź metodami chemicznymi.
• Wydzielone enzymy są najczęściej oczyszczane metodami frakcjonowania rozpuszczalnikami organicznymi lub obojętnymi solami, metodami adsorpcji, chromatografii jonowymiennej i krystalizacji. Frakcjonowanie enzymów rozpuszczalnikami organicznymi (etanol, izopropanol, aceton metanol, dioksan) jest prowadzone w neutralnym środowisku o małej sile jonowej w temperaturze od -5 do -20°C.
• Powszechne jest kilkukrotne frakcjonowanie obojętnymi solami (siarczanem (VI) amonu, siarczanem (VI) magnezu lub sodu oraz octanem sodu lub magnezu. Koncentraty enzymów są oczyszczane techniką chromatografii jonowymiennej, powinowactwa i żelowej. Dwie pierwsze umożliwiają szybkie oczyszczanie dużych ilości ….…. enzymów , ale niższe ceny tych jonitów przemawiają za ich stosowaniem we wcześniejszym etapie oczyszczania.
• Jonity polistyrenowe są szczególnie przydatne do oczyszczania enzymów w skali przemysłowej. Metoda chromatografii powinowactwa wykorzystująca specyficzne korelacje między nimi a immobilizowanym ligandem, którym może być substrat, bądź współzawodniczący inhibitor enzymu, bądź barwnik, bądź przeciwciała pozwala na oczyszczenie enzymu kilka tysięcy razy, jednak ze względu na bardzo duże koszty nie jest jeszcze powszechna w skali przemysłowej.
• Końcowe oczyszczanie enzymów jest prowadzone metodą chromatografii, eksluzji w żelu usieciowanym dekstranami (Sephadex seria G), poliakryloamidami, pochodnymi sacharozy (Sepharose Cl), mieszaninami poliakrylamid- agarowa
• Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) frakcjonowanie w r-rach z jonami metali ciężkich (ołowiu, rtęci, cynku, żelaza), najczęściej w połączeniu z innymi metodami np. z frakcjonowaniem alkoholami lub solami.
• Niezwiązane jony metali są oddzielane od białek metodami membranowymi (dializa, ultrafiltracja) przez obniżenie pH środowiska lub na kationitach. Największą……… ma selektywna adsorpcja enzymów realizowana techniką kolumnową

Zastosowanie enzymów:
- przemysł spożywczy
- 100 tys. ton rocznie- światowa produkcja handlowych preparatów enzymatycznych Dania, Holandia, USA, Japonia, Niemcy
-130 firm produkujących enzymy- Novo Nordik AIS, Zakłady Przemysłu Owocowo- Warzywnego (ZPOW), „Pektowin” w Jaśle – głownie proteazy, amylazy i pektynazy pochodzenia mikrobiologicznego.
Enzymy amylolityczne
- gorzelnictwo- słód pleśniowy
- przemysł ziemniaczany (przy produkcji glukozy ze skrobi i wyrobie syropów skrobiowych, izomeraza glukozowa -> fruktoza (b. słodki)
- piekarnictwo- dodatek do mąki, krótszy czas fermentacji ciasta
- przemysł paszowy- większa strawność pasz
- browarnictwo- stosowanie surowców niesłodowanych

Preparaty pektynolityczne
- klarowanie soków owocowych i warzywnych, maceracja miazgi, z której wyciska się sok
- klarowanie win
- produkowane przez grzyby (Aspergillus niger)

Enzymy celulolityczne
- działają na błonnik
- hydroliza składników drewna, rozkład hemiceluloz -> fermentacja alkoholowa
- mogą być poddawane zdrożdżowaniu- mogą być na nich hodowane drożdże dla celów genowych lub spożywczych
- produkcja pasz zwierzęcych
- drogie preparaty przemysłowe
Produkcja: grzyby Trichoderma reesei, T. lignorum, Trichothecium roseum, Aspergillus terreus, Geotrichum candidum i inne.
Preparaty proteolityczne
- produkcja: grzyby Aspergillus oryzae i bakterie B. substilis
- przemysł mięsny do zmiękczania (kruszenia) mięsa, wołowiny
- przetwórstwo rybne
- przemysł koncentratów spożywczych- produkcja hydrolizatów białkowych
- piekarnictwo
- browarnictwo- zwiększenie trwałości piwa, przeciwdziałanie zmętnieniu białkowemu
- garbarstwo- enzymatyczne zmiękczanie odwłasiania (depilacji) skór- usuwanie z nich szczeciny i włosia
Chymozyna - (endopeptydaza) katalizuje przejście kazeino genu mleka w nierozpuszczalną kazeinę (sernik)- wytwarzanie serów podpuszczkowych twardych (A.niger) proteinazy asportylowe (kwaśne proteinazy, reszta kw. asparaginowego w centrum aktywnym) substytut zwierzęcych proteinaz, pepsyny i renniny w produkcji serów.
- modyfikacje białek w surowcach spożywczych- enzymatyczne zmiany funkcjonalnych właściwości białek: rozpuszczalność, lepkość, zdolność do tworzenia emulsji, zmiana smaku
- enzymatyczna hydroliza glutenu w mące pszennej w celu poprawy charakteru ciasta do pieczywa o przedłużonej trwałości.
- proteinazy w produktach środków piorących- usuwanie z tkanin tłuszczów, skrobi, krwi, także amylaz i lipaz.
- bakteryjne proteazy- produkcja enzymatycznych środków piorących

Oksydaza glukozowa i katalaza
- przeciwutleniacze do stabilizacji (utrwalania) białka jaj, piwa, win i soków owoców cytrusowych. Suszone białko jaj ma tendencję do szybkiego brunatnienia podczas przechowywania na skutek powstawania reakcji aminokwasowych. Aminokwasy łącząc się z cukrami dają substancje pigmentujące typu zw. Millarda. Oksydaza glukozowa powoduje utlenienie glukozy, przez co nie zachodzi zmiana barwy.
- utrwalanie chleba w opakowaniu przez usuwanie glukozy i tlenu- brak substratu dla grzyba
- produkcja: drożdże i grzyby strzępkowe z gatunku A.niger
Inwertaza (β-fruktofuranozydaza)- otrzymywana z drożdży, wykorzystywana w przemyśle cukrowniczym do inwersji karmelu i przy wyrobie mas cukierniczych
Laktaza (β-galaktozydaza)- drożdże Kluyveromyces fragilis lub K. lactis, A. niger, Penicillium. Hydrolizuje on laktozę do glukozy i galaktoz, przez co zwiększa słodycz mleka i otrzymywane z niego przetwory. Stosowany w produkcji mleka kondensowanego, koncentratów serwatkowych.
Lipazy- powodują deestryfikację tłuszczów w wolne kw.tłuszczowe i glicerol, do produkcji środków piorących
Ostatnie lata przyniosły zainteresowanie preparatami enzymatycznymi wykazującymi aktywność w warunkach ekstremalnych- duża termostabilność, działanie w skrajnych pH środowiska. Utrzymanie termostabilnego lizozymu faga T4 hamującego wzrost bakterii Clostridium wywołującego psucie się sera.
Enzymatyczna kataliza lipaz prowadzona z udziałem rozpuszczalników organicznych- przemiana oleju oliwkowego i kwasu stearynowego w tłuszcz jadalny- zmiana zestawu kwasów tłuszczowych w trój glicerydach wprowadzając nienasycone kw.tłuszczowe.
Suche preparaty enzymów zawierające minimalną ilość wody hydratacyjnej zachowują swoje podstawowe właściwości w rozpuszczalnikach organicznych.

Otrzymywanie kw. organicznych
Kw. glukozowy metoda okresowa lub ciągła hodowla wgłębna w 30-32°C przy intensywnym mieszaniu i napowietrzaniu w ciągu 1-2 dni przez A.niger w pożywce z glukozą, związkami azotowymi fosforowymi, biostymulatorami i makro- i mikroelementami w pH 6-6,5 korygowanym węglanem wapnia,wodorotlenkiem sodu lub potasu
- wapniowe, sodowe lub potasowe sole kw. są wydzielane z filtratu po oddzieleniu biomasy.


Synteza kwasów
- metoda półciągła – skrócenie cyklu produkcyjnego, ponieważ nie wytworzona grzybnia może być wykorzystana potem przez szereg następnych cykli produkcyjnych
- wykorzystuje się ją tak długo, jak długo zachowuje ona właściwą aktywność biochemiczną, pierwszy cykl trwa dłużej

Zastosowanie kw. glukonowego
- produkcja światowa kw. glukonowego i jego pochodnych oceniana jest na ok. 50 tys. ton rocznie
-przemysł spożywczy- napoje orzeźwiające, cukierki, czynnik hydrolityczny przy otrzymywaniu inwertu przy wyrobie miodu sztucznego
- glukoniany są stosowane do ochrony produktów spożywczych przed utlenieniem
- glukonian sodu łącznie z sodą kaustyczną – proces automatycznego mycia butelek
- glukoniany potasu zapobiegają gromadzeniu się soli wapnia, magnezu i żelaza w elementach instalacji przemysłowych stosowanych w układach chłodniczych i grzewczych

Przemysł farmaceutyczny:
- glukoniany stosowane są jako dodatek do antybiotyków w celu poprawy ich stabilności i zwiększenia rozpuszczalności, przez co wzrasta ich poziom we krwi i obniża działanie zw. toksycznych
- łącznie z kw.salicylowym i acetylosalicylowym do produkcji aspiryny
- preparaty glukonianu wapnia- przyswajalne źródło wapnia dla ludzi i zwierząt, leczenia brucelozy u krów
- zdolności glukonianu do częściowego rozpuszczania skrzepów krwi- w medycynie

Przemysł tekstylny
- glikonian sodu- wybielanie i nabłyszczanie tkanin
Przemysł metalurgiczny
- oczyszczanie powierzchni matali przed nakładanie powłok ochronnych
Budownictwo
- dodatek do cementów- wzmocnienie siły wiązania i poprawa parametrów technicznych
- fotografia i litografia
- garbowanie skór

Biosynteza kw. cytrynowego
Przemysł spożywczy- poprawa smaku potraw i środek konserwujący
- kwas cytrynowy lub cytrynian sodu- chemia gospodarcza w produkcji proszków do pieczenia i płynów myjących
- przemysł farmaceutyczny i chemiczny- występuje w owocach cytrusowych (cytrynach). Początkowo otrzymywano go z owoców
- obecnie 1% tego surowca wytwarzany jest ze źródła naturalnego
- większość wytwarzana metodami biotechnologicznymi z wykorzystaniem drobnoustrojów
- wyselekcjonowane szczepy grzybów strzępkowych- A. niger lub A. wenti
- Europa: główny surowiec melasa (do 50% sacharozy) lub czysta sacharoza
- USA: hydrolizowana skrobia kukurydziana
- Japonia: frakcje ropy naftowej- Candida
Cytrynian- ważny metabolit pośredni powstający podczas rozkładu różnych związków w przemianach mających na celu pozyskanie energii przez organizmy rosnące w warunkach tlenowych. W przypadku szczepów Aspergillus cząsteczki heksozy są asymilowane w dwóch szlakach metabolicznych- szlaku glikolitycznym i cyklu Krebsa.
- w czasie wzrostu grzybni funkcjonują obydwa te szlaki z blisko dwukrotna przewagą glikolizy.
- w drugiej fazie wzrostu (w idiofazie)- nagromadzenie kwasu cytrynowego w wyniku zmian aktywności enzymów, cykl Krebsa zostaje praktyczne zablokowany na etapie przemian kw. cytrynowego- aby komórki grzyba mogły tworzyć dalsze ilości kw. cytrynowego istnieją reakcje dostarczające prekursorów niezbędnych do jego dalszej syntezy
- taką reakcją wspomagającą (anaplerotyczną) jest karboksylacja kw. pirogronowego do kw. szczawiooctowego
- 2 cząsteczki kw. pirogronowego powstałe na drodze glikolizy ulegają, przy współudziale koenzymu A, przemianom do acetylo-CoA i kw. szczawiooctowego. Następnie te 2 cząsteczki przy udziale syntazy cytrynianowej ulegają kondensacji do kw. cytrynowego z uwolnieniem CoA.
Biosynteza antybiotyków

Antybiotyki - definicje:
- Waksmana - substancje chemiczne wytwarzane przez drobnoustroje i mające w dużych rozcieńczeniach zdolność zabijania lub hamowania wzrostu innych drobnoustrojów,
- współczesna – małocząsteczkowe substancje naturalne, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich półsyntetyczne modyfikacje, bądź też syntetyczne analogi, które w małym stężeniu działają wybiórczo na struktury i procesy metaboliczne innych drobnoustrojów.

Budowa chemiczna antybiotyków
- pochodne aminokwasów
• antybiotyki β-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny)
• a. polipeptydowe (polimyksyna, cyklosporyna)
• a. glikopeptydowe ( bleomycyna, mankomycyna)
• a. depsypeptydowe (walinomycyna)
• a. lipopeptydowe (daptomycyna)
- poch. Cukrów
• aminoglikorydy (streptomycyna, gentamycyna)
• glikolipidy (moenomycyna)
- a. makrocykliczne
• makrolidy właściwe (erytromycyna, oleandromycyna)
• makrolidy polienowe (amfoterycyna B, nystatyna)
• ansamycyny
- chinony i ich pochodne
• antracykliny (daunorubicyna, aklarubicyna)
• tetracykliny (chlorotetracyklina, oksytetracyklina)
• benzochinony (mitomycyna)
- inne
• pochodne cykloalkanów (cykloheksimid)
• nukleozydy (poliaksyna)
• zw. aromatyczne ( chloramfenikol)
• zw. fosfoorganiczne (fosfomycyna)
• zw. steroidowe (kw. fusydowy)
• polietery (lasalacid)

Działanie antybiotyków
- działają na struktury kom. lub ukł. enzymatyczne spełniające istotne dla wzrostu i rozmnażania kom. funkcje
• synteza kw. nukleinowych – replikacja DNA (mitomycyna, bleomycyna), synteza RNA (ryfamycyny)
• synteza białka na rybosomach ( aminoglikozydy, makrolidy niepolienowe, chloramfenikol, tetracykliny)
• transport przez błony biol. (polimyksyny, amfoterycyny, jonofory, nystatyna, gramicydyna)
• synteza składników ściany kom. (ant. β-laktamowe, cykloseryna, bacytracyna, wankomycyna)
• procesy energetyczne ( antymycyna, oligomycyna)
Antybiotyki wykazują aktywność
- przeciwbakteryjną (penicyliny, cefalosporyny, aminoglikozydy)
- przeciwgrzybową (amfoterycyna, nystatyna, pimarycyna)
- przeciwnowotworową (aktynamycyna, bleomycyna, daunorubicyna)
- immunosupresyjną ( cyklosporyna A)
- przeciwrobaczą (awermektya)
- przeciwpierwotniakową (lasalacid, monenzyna)
- insektycydową (tetranyktyna)
- herbicydową (bialafos)

Przeciwbakteryjne działanie antybiotyków może być:
- ogólne – szerokie spektrum działania (cefalosporyny, tetracykliny, ryfamycyny)
- wybiórcze - np. bakterie G+ (większość penicylin, cykloseryna)
Efekt (skuteczność) działania a. może być bakteriobójczy (a. β-laktamowe, aminoglikozydowe) lub bakteriostatyczny (cykloseryna, wiomycyna) albo zależy od stężenia (makrolidy niepolienowe, tetracykliny – działają bateriobójczo w wysokim stężeniu, a bakteriostatycznie w terapeutycznym).
Do antybiotyków NIE ZALICZA SIĘ bakteriocyn – białkowych produktów bakteryjnych, skierowanych przeciwko innym szczepom.

Poszukiwanie nowych naturalnych oraz chemicznie modyfikowanych antybiotyków
Przyczyny:
- szybkie narastanie i rozprzestrzenianie się wśród drobnoustrojów oporności na stosowane już antybiotyki
- silne działanie toksyczne wielu spośród stosowanych a. (np. aminoglikozydowe, polienowe, peptydowe), co stanowi duży problem w antybiotykoterapii nowotworów
- coraz częstsze zakażenia bakteriami G-, beztlenowymi, oportunistycznymi
- pojawianie się chorobotwórczych szczepów bakterii dotychczas uważanych za saprofityczne
Cel:
- poprawa ich właściwości farmakologicznych (aktywność, wchłanialność, stabilność, czas działania i in.)
- zminimalizowanie skutków ubocznych
Wyścigi z patogenami
- terapia wieloelementowa (HAART, np. AIDS)
• pojedyncze leki przeciwwirusowe nie są skuteczne – bardzo szybko ewoluują oporne wirusy
• sposób – stosowanie kilku różnych leków działających na różne procesy cyklu życiowego wirusa – nie daje szansy na wyewoluowanie oporności
Oprócz stosowania w leczeniu ludzi antybiotyki stosuje się:
- w weterynarii (tetrackliny, makrolidy, β-laktamowe, aminoglikozydy) – są to a. takie jak w medycynie ludzkiej, ale powstają też leki projektowane specjalnie dla zwierząt
- w rolnictwie – do ochrony upraw roślin, są to a. nieużywane w lecznictwie (blastycydyna S, polioksyna)
- jako dodatki do pasz do żywienia trzody chlewnej, cieląt, drobiu – sprzyjają szybszemu wzrostowi zwierząt, gdyż selektywnie oddziałują na mikroflorę przewodu pokarmowego umożliwiając bardziej ekonomiczne wykorzystanie składników paszy.

Głównymi producentami a. są drobnoustroje:
- najważniejsze a. przeciwbakteryjne – produkowane w największych ilościach w procesach biosyntezy – penicylina G i cefalosporyna są metabolitami grzybów Penicillium notatum lub Penicillium chrysogenum i Cefalosporium acremonium.
Ponadto do produktów grzybów należą także:
- kw. fusydowy (Fusidum cocineum)
- wariotyna
- immunosupresyjan cyklosporyna C

Biogeneza i regulacja biosyntezy
Drobnoustroje syntetyzują olbrzymią liczbę metabolitów o bardzo zróżnicowanej aktywności biol. (enzymy, stymulatory wzrostu, leki, dodatki do żywności itp.). Wśród poznanych dotąd zw. aktywnych farmakologicznie dominują antybiotyki (ok. 10000). Jest to najprawdopodobniej wynikiem jednostronnego skriningu ostatnich lat. Szacuje się, że w przyrodzie antybiotyki stanowią do 10% puli tzw. metabolitów wtórnych (idiolitów).
Biosynteza metabolitów jest ściśle powiązana z centralnymi szlakami degradującymi i podstawowymi syntezami kom. poprzez n metabolity pośrednie i prekursory. Do prekursorów należą m.in.: ufosforylowane sacharydy, fosfoendopirogronian, acetylo-CoA, aminokwasy białkowe. W niektórych antybiotykach obok „normalnych” α-L-aminokwasów stwierdza się D-aminokwasy (D-alanina w cyklosporynach, D-fenyloalanina w gramicydynie S).
Szczepy dzikie, izolowane ze środowisk naturalnych produkują w warunkach optymalnych niewielkie ilości antybiotyków.
Uzyskanie wysoko wydajnych szczepów produkcyjnych jest możliwe praktycznie tylko po trwałych zmianach genetycznych, naruszających układy regulacyjne. A. nie pełnią zasadniczych funkcji metabolicznych, stąd ich synteza podlega silnej represji w warunkach sprzyjających wzrostowi. Zniesienie tego zahamowania następuje zwykle w war. ograniczenia lub zahamowania wzrostu drobnoustr. w późnym okresie rozwoju hodowli (idiofaza).

Biosynteza i regulacja biosyntezy
Mechanizmy wpływające na produkcję idiolitów:
- wyczerpanie się w podłożu łatwo przyswajalnych składników pożywki (glukoza, jon amonowy, jon fosforanowy)
- zniesienie mechanizmu represji katabolicznej (glukoza hamuje produkcję penicylin, cefalosporyn, neomycyny) – efektywnośćsyntezy antybiotyków zależy nie od rodzaju źródłą węgla i energii, ale od tempa jego zużywania, szybkości generacji energii metabolicznej i dostarczania pośrednich produktów.
Możliwe są 2 sposoby zmiany struktury naturalnych antybiotyków:
- modyfikowanie metodami chemicznymi – podstawowa metoda doskonalenia większości stosowaych obecnie antybiotyków
- biotransformacja enzymatyczna – rzadziej stosowana, ostatnio głównie w stosunku do a. β-laktamowych.
Drobnoustr. i org. wyższe mogą prowadzić różne typy reakcji enzymatycznych w różnych miejscach cząst. antybiotyków – utlenianie i redukcja, hydroliza, diacylacja.



Pod względem toksyczności dla zwierząt a. można podzielić na 3 grupy:
1). a. praktycznie nietoksyczne – mogą być podawane w dużych dawkach (granica 0,5g/kg masy ciała): penicylina, streptomycyna, aktynomycyna
2). a. toksyczne – dawka letalna 100mg/kg masy ciała: gramicydyna
3). a. wysoce toksyczne – dawka letalna 1,5mg/kg masy ciała: kw. aspergilowy.

Produkcja penicyliny i streptomycyny
- grzby Penicillum chrysogenum bądź P. notatum – penicylina
- szczepy te hoduje się na podłożach płynnych o składzie: wyciąg namokowy z zirna kukurydzy (względnie z jęczmienia), laktoza (1-4%) oraz subst. mineralne niezbędne dla rozwoju grzybów. Wyjściowe pH podłoża wynosi ok. 4
- wyprowadzone z tych kultur zliofilizowanych szczepy przesiewa się na skosy pożywką stałą. Wyrosłe na skosach konidia grzyba służą do zaszczepienia pożywki stałej w kolbach Roux.
- dalsze etapy namnażania prowadzą już poprzez stosowanie podłoży płynnych składem swoim zbliżonych albo identycznych z podłożem przemysłowym, a więc zawierających namok, sole mineralne i laktozę. Często wszystkie rodzaje podłóż stosowanych do produkcji penicyliny zawierają jeszcze dodatek kw. fenylooctowego stymulującego prod. penicyliny
- jedyną metodą prod. penicyliny jest m. wgłębna – m. powierzchniowa stwarza trudności z zachowaniem jałowości środ. Hodowla jest intensywnie mieszana (obroty mieszadła wynoszą 300obr/min) oraz napowietrzana (sterylne powietrze w ilości równej objętości płynu fermentacyjnego w ciągu 1min)

Fazy procesu fermentacji
1). I faza – pierwsze dwa dni, silny rozwój grzybni (synteza białka kom.). Wraz z silnym rozwojem grzybni obserwuje się znaczne wykorzystanie z podłoża zw. azotowych, które służą do syntezy białka kom. Ten pierwszy okres charakteryzuje się również lekkim wzrostem odczynu środowiska do pH ok. 7
2). II faza – szybkie zużycie cukrów, nieznaczny wzrost kwasowości. Procesy rozwojowe grzybni w tym okresie zaczynają zdecydowanie słabnąć (rozwój grzybni zostaje ograniczony). W związku z tym maleje też zużycie azotu, natomiast dochodzi do maks. nagromadzenia w podłożu penicyliny. Jest to główna faza produkcyjna. Wydajność 850000jednostek penicyliny w 1ml.

Proces wydzielania penicyliny
- pierwszy etap – usunięcie wytworzonej grzybni przez filtrowanie lub odwirowanie. Sklarowany roztwór zaw. penicylinę w postaci wolnego kwasu - w tej formie penicylina ma tendencję łatwiejszego rozpuszczania w niektórych rozp. org.: octan amylu lub chloroform. W tej sytuacji penicylina (kw. penicylinowy) przechodzi do frakcji rozp. org. – można ja w ten sposób oddzielić od reszty roztworu. Fazę wodną odrzuca się. Następnie penicylinę neutralizuje się NaOH i w tej formie soli sodowej penicylina jest bardziej rozpuszczalna w wodzie niż w rozpuszczalnikach. Proces oczyszczania penicyliny polega na wielokrotnym przechodzeni penicyliny z frakcji rozp. org. do frakcji wodnej i na odwrót. Ostatni etap to wydzielenie penicyliny (w formie krystalicznej). Robi się to w dwojaki sposób. Pierwszy polega na określeniu aktywności roztworu macierzystego (roztworu wodnego soli sodowej penicyliny), jego przefiltrowaniu przez filtr bakteryjny i rozlaniu. Cały roztwór oczyszczonej penicyliny poddaje się procesowi liofilizacji w dużych płytkich tacach, po czym namnaża się je po prostu do fiolek. Po rozmnożeniu buteleczki zamyka się ją korkami gumowymi, które potem wzmacnia się kapslem metalowym. Penicyliny półsyntetyczne – substrat kw. 6-aminopenicilanowy (6-APA), z którego metodami chem. lub enz. uzyskuje się pochodne β-laktamowe.

Cechy jakościowe antybiotyków
- moc a. – liczba jednostek antybiotycznych w 1mg suchego preparatu
- jednostka antybiotyczna – najwyższe rozcieńczenie antybiotyku, które jeszcze wywołuje efekt antybiotyczny w stosunku do testowego mikroorg. ( w przypadku penicyliny jest to Staphylococcus aureus – gronkowiec złocisty. W stosunku do niektórych a. jednostka ant. jest po prostu czystego preparatu.
Przed skierowaniem do sprzedaży penicylina jest sprawdzana pod kątem aktywności, wilgotności, stanu jałowości preparatu i toksyczności i te cechy muszą odpowiadać przyjętym normom.

Produkcja streptomycyny
Streptomycyna – antybiotyk syntetyzowany przez promieniowce. Po raz pierwszy streptomycynę wyodrębnił Welksman w hodowli promieniowców Streptomyces griseus w 1944r. – Nagroda Nobla.
Trzy zasadnicze etapy produkcji jak syntezie penicyliny tj. przygotowanie inokulum, fermentacja główna w fermentorach przemysłowych, wyodrębnianie i oczyszczanie tego antybiotyku oraz uzyskanie go w formie krystalicznej.

5 2012-06-20
26.04 – Piwo:

3 typy:
1. fermentacji
2. fermentacji dolnej
3. fermentacji kombinowanej

Fermentacja dolna – Saccharomyces cerevisiae var uwarum, opt. temperatura 6°C, gromadzą się na dnie kadzi.
Fermentacja górna- Saccharomyces cerevisiae, opt. Temp. 16°C, gromadzą się przy powierzchni powstającego piwa.

Etapy produkcji piwa

1. Przygotowanie słodu

Wskaźniki dobrej jakości ziarna, barwa łuski, masa
Słód- podstawowy surowiec do produkcji piwa otrzymywany ze zboża (gł. Jęczmienia lub pszenicy). Najodpowiedniejszy jest jęczmień dwurzędowy (orkisz, płaskur?), ponieważ w porównaniu z wielorzędowym jęczmieniem (jęczmieniem zwyczajnym), ma korzystniejszy kształy, niską zawartość białka oraz własności technologiczne.
Jęczmien – Graminare, ozimy lub jary
• Czyszczenie jęczmienia- mielnica złożona z komory powietrznej i zestawu sit. Drugi etap – oczyszczenie zasadnicze za pomocą elektromagnezu usuwa się zanieczyszczenia ferromagnetyczne.
• Moczenie ziarna – biochemiczna aktywacja, odbywa się w kadziach zaciernych.
• Kiełkowanie – wydzielane są enzymy i substancje łatwo rozpuszczalne w trakcje zacierania słodu, temperatura 12-22°C, wilgotnośc 43-44%, stymulatory: kwas giberelinowy lub bronian potasu, trwa 5-8 dni(proces kiełkowania)
• Suszenie słodu – w celu uzyskiwania właściwego zapachu i aromatu, wymagana wilgotność docelowa to ok. 4%. Ze względu na zastosowanie odpowiedniej temperatury wyróżniamy słody jasne i ciemne . słód ciemny ma zwykle niższą siłę amylolityczną. Suszenie odbywa się w czasie 2x12h (słód jasny) i 2x24h (słód ciemny). Stopniowo podnosi się temperaturę od około 50°C do 80° w ostatniej.
• Odkiełkowanie słodu – kiełki usuwa się gdyż, mają gorzki smak i psuja jakość piwa. Odbywa się to w bębnie obrotowym z urządzeniem cepowym w środku odłamującym kiełki , które następnie oddziela się na sitach.

Słód browarniczy – słód krótki (jego okres produkcji nie trawa dłużej niż 7-8 dni). Jest zawsze suszony przed użyciem do produkcji piwowarskiej. Chodzi o uzyskanie takiej ilości enzymów amylolitycznych, które były by w stanie zhydrolizować skrobie własna ziarna jęczmiennego.
Brzeczka- wodny wyciąg ze słodu zawiera białka, aminokwasy, dekstryny, substancje goryczkowe, garbniki, sole mineralne i cukry fermentacyjne – przede wszystkim maltozę.
• Śrutowanie słodu- młynek
• Zacieranie w kadziach zaciernych temp. 48-78°C . ma na celu przejście składników organicznych do roztworu.
• Filtracja – oddzielenie brzeczki od nierozpuszczalnych składników tzw. Wysłodzin- białkowe odpady wykorzystywane jako pasza.

Metody zacierania

Dwie zasadnicze metody zacierania
• Metoda dekokcyjna
• Metoda infuzyjna
W Europie niemal wyłącznie stosowana jest dekokcyjna metoda zacierania. Może być ona prowadzona 3 systemami: systemem trój-, dwu- lub jednopenwaniowym (penwia- zbiornik). Polega to na tym, że śrut słodowy, tzw. Zasyp wprowadza się do kadzi zaciernej, miesza się go z określoną ilością wody czyli z tzw. Zalewem. Te dwa czynniki czyli śrut słodowy i woda mogą być użyte w różnych ilościach (w różnych stosunkach) i w skutek tego uzyskuje się brzeczkę bardziej lub mniej ekstraktywną.

Metoda dekokcyjna
Po zmieszaniu śrutu słodowego i wody w kadzi zaciernej doprowadza się temperaturę wyjściową uzyskanego zacieru do 35°C. Następnie w metodzie dekokcyjnej trójwapniowej, 1/3 tego zacieru przerzuca się do kotła zaciernego, gdzie ten pierwszy war ogrzewany jest do wrzenia a następnie gotowany przez 20 min. Z tym jednak , że w trakcie ogrzewania tego pierwszego waru w kotle zaciernym stosujemy dwie przerwy – pierwsza po ostygnięciu do temp. 50°C. Wówczas przerywany dalsze ogrzewanie na 10 min i to jest tzw. przerwa białkowa optymalna dla działania enzymów proteolitycznych. Po upływie 10 min. Proces ogrzewania jest kontynuowany do 62-63°C, po czym ponownie przerywa się dalsze ogrzewanie na czas 15-20 min i to jest druga przerwa tzw. scukrzającą. Analogicznie jak przy przerwie białkowej chodzi tutaj o podtrzymanie temperatury optymalnej dla działania enzymów amylolitycznych, a więc dla przeprowadzenia procesu scukrzania skrobi własnej słodu na cukry proste, tzn. przynajmniej do maltozy.
Po upływie 15-20 min ogrzewanie prowadzi się Az do wrzenie i zacier jest gotowany w kotle zaciernym przez ok. 20 min. Po tym czasie ten pierwszy war zagotowanego zacieru zawracany jest ponownie do kadzi zaciernej, gdzie łączony jest z zacierem głównym i w skutek tego temperatura w kadzi zaciernej podnosi się do 50°C. Wtedy z kadzi zaciernej pobiera się drugi war, który z kolei znowu przerzuca się w ilości 1/3 do kotła zaciernego. Podobnie jak za pierwszym razem, ten drugi war jest znów ogrzewany w kotle zaciernym do wrzenia i gotowany przez 20 min. Również i tym razem stosuje się przerwę, ale teraz jest tylko jedna- stosuje się tylko prerie scukrzającą po osiągnięciu temp. 62-63°C. W trakcie ogrzewania drugiego waru w kotle zaciernym, pozostała ilość zacieru w kadzi zaciernej przechodzi w tym czasie przerwę białkową, ponieważ temp. wynosi 50°C. Ten drugi war po przerwie scukrzającej jest doprowadzany do wrzenia, gotowany przez 20 min i po tym czasie znów łączony z całą pozostałą częścią zacieru w kadzi zaciernej. Wskutek tego zabiegu temp. zacieru głównego ulega podwyższeniu do 63°C.
Następnie pobiera się ostatni trzeci war w ilości 1/3 części. Przerzuca się go ponownie do kotła zaciernego i tam poddaje się go ogrzewaniu, tym razem już bez żadnej przerwy, do stanu wrzenia i gotuje w czasie 20 min. w tym czasie pozostały zacier główny przechodzi przerwę scukrzającą, gdyż jego temp. wynosi 62-63°C. Z chwilą kiedy ten trzeci zacier zostaje nawrócony i połączony z zacierem głównym w kadzi zaciernej i temperatura zacieru osiągnie poziom ok. 75°C to jest koniec zacierania. Cały proces zacierania prowadzony systemem trójpenwapniowym trwa w sumie 5-6h z tym jednak, ze w browarnictwie nie zawsze stosuje się metodę dekokcyjną




Metoda infuzyjna
Proces scukrzanie prowadzi się w kadzi zaciernej bez stosowanie warów w drodze stopniowego ogrzewania. Stosuje się tutaj ogrzewanie całego zacieru do temp. końcowej ok. 70 °C stosując dwie przerwy: białkową 50°C i scukrzającą 62-63°C.

Chmiel
Cumulus lapus- rozdzielnopłciowa pnąca bylina z rodziny Cannabis należąca do rzędu Urticales- tego samego co pokrzywa czy konopie indyjskie. Bez tego składnika piwo nie byłoby piwem, odpowiada za jego aromat (goryczkę i trwałość, właściwości antyseptyczne). Używane są szyszki chmielowe. Żywice chmielowe maja działanie bakteriostatyczne, poprawiają smak i wpływają na stabilność piany. Podobnie jak jęczmień, chmiel ma również wiele wskaźników jakości, np. barwa lupuliny- gruczoły w listkach okrywających, zapach, połysk, długość ogonka i wiele innych. Stosując go w postaci ekstraktów czy koncentratów (proszki, granulaty).

Składniki w chmielu
1. olejek chmielowy – subst. oleista, płynna, przeźroczysta o barwie lekko żółtej, słabo rozpuszczalna w wodzie, dobrze rozpuszczalna w eterze, mająca charakterystyczny zapach (aromat) typowy dla produktu finalnego - piwa. W skład olejku chmielowego wchodzą: seskwiterpen hunsulen C15H24 i myrcen C10H16. Te 2 olejki terpenowe stanowią 80-90% wszystkich składników olejku chmielowego i mają zasadnicze znaczenie jeśli chodzi o wykorzystanie ich do celów technicznych.
2. substancje goryczkowe- występują w postaci ciał krystalicznych i bezpostaciowych. Wśród nich jako ciała krystaliczne występują kwasy goryczkowe. Wyróżniamy dwa rodzaje tych kwasów: α kw. goryczkowy – humulon i β kw. goryczkowy – lupulon (nazwy pochodzą od nazwy gatunkowej chmielu). Ciała bezpostaciowe: α i β żywice miękkie i γ żywica twarda. Miedzy tymi związkami istnieje ścisła wieź gen- kw. α i β goryczkowy pod wpływem utlenienia przechodzą w postać α i β żywić miękkich, a β kwas goryczkowy w β żywicę miękką. Dalsze procesy utwardzania tych kw. prowadzą do przemiany miękkich żywic α i β w γ żywicę twardą. Kwas goryczkowe i żywice miękkie maja pełna wartość technologiczną tzn. są dobrze rozpuszczalne w wodzie i przechodzą podczas gotowania z brzeczka do piwa. Żywica twarda jest technologicznie nie przydatna, nie jest rozpuszczalna.
3. substancje garbnikowe- występują głównie w listkach szyszek i podczas gotowania z brzeczką są w znacznej mierze ługowane do roztworu brzeczki, gdzie występują częściowo również w stanie związanym z białkiem. Często jednak nie powodują koagulacji białkowej i dostają się do piwa również w postaci połączeń garbnikowo – białkowych lub są tam obecne w stanie naturalnym.

Uchmielanie brzeczki

Gotowanie brzeczki z chmielem, odbywa się w kotle warzelnym, w którym gromadzona jest sklarowana po procesie filtracji brzeczka. Następnie do brzeczki tej dodaje się chmiel, a częściowo ekstrakt chmielowy. Chmiel dodawany jest porcjami lub od razu, a jego ilości zalezą od asortymentu piwa i wahają się 150-550 g/hl brzeczki.
Piwa jasne wymagają dodania ok. 300 g, zaś ciemne 150 g chmielu/hl brzeczki. Po dodaniu chmielu brzęczkę ogrzewa się do wrzenia – właściwy proces warzenia piwa , w wyniku którego substancje zawarte w chmielu przechodzą do brzeczki.
Podczas gotowania chmielu z brzeczka powstają straty, które opadają na dno kotła. Następuje wyklarowanie brzeczki, które w języku piwowarskim określa się jako tzw. łamanie brzeczki. Gotowanie jest również pewną formą sterylizacji. Brzeczka wygotowana i chmielona jest sterylna. Po wygotowaniu w ciagu 1,5-2,5 h gorąca brzeczkę spuszcza się z kotła warzelnego (wybicie brzeczki) i wprowadza się ją na urządzenie zwane odchmielaczem (cedzakiem chmielowym) w celu odfiltrowania.

Chłodzenie brzeczki

Klarowna brzeczka z podchmielonymi częściami stałymi chmielem poddawana jest nastepnie procesowi, który polega na jej wychłodzeniu.
W browarach stosuje się zamknie system chłodzenia brzeczki.

Transport brzeczki do kadzi fermentacyjnych

• Po schłodzeniu brzeczka kierowana jest do kadzi fermentacyjnych (w piwnicach). Temperatura utrzymywana na poziomie 5-6°C- system klimatyzacyjny.
• Kadzie fermentacyjne maja 2 otwory odprowadzające : boczny na wys. 10-15 cm od dna i drugi na samym dnie. Otwór boczny służy do odprowadzania młodego piwa.

Drożdże

• Odpowiadają za fermentacje
• Drożdże piwowarskie: Saccharomyces calsbergenesis – f. dolna
• Saccharomyces cerevisiae- f. górna

Cechy charakterystyczne drożdży:
• Przeprowadzanie fermentacji alkoholowej, która zmienia wychmieloną brzeczkę słodową w piwo
• Czystość mikrobiologiczna
• Jednolitość rasy
• Duże zdolności fermentacyjne
• Brak w piwie posmaków obcych

Piwa fermentacji dolnej i górnej piwo fermentacji spontanicznej

Substraty:

Maltoza, sole amonowe jako źródło azotu – aminokwasy i krótkie peptydy. Drozdze potrzebują do wzrostu soli. Enzymy wspomagające starzenie, przeciwutleniacze poprawiające smak i trwałość piwa (Wit. C, siarczyn sodu), a czasem kwas mlekowy.

Wyprowadzenie drożdży zarodowych (nastawianie drożdży )
• Pierwszy etap – kolba Calsberga, namnażanie kultury przemysłowej drożdży browarniczych
• Po namnożeniu drożdży zaszczepia się brzeczkę w propagatorze i zaszczepia kadź fermentacyjną
• Pozostawia się niewielką ilość drożdży służącą jako inokulum



Fermentacja

Na każde 100dm3 (l) brzeczki używa się O0,5 dm3 gęstwy drożdżowej. Dopiero po 10 takich rotacjach wyprowadza się drożdże zarodowe do kultury laboratoryjnej. Proces fermentacji alkoholowej trwa ok. tygodnia, temperatura 12°C, cisnienie ok. 0,4 bar

Etapy fermentacji

1. zasianie drożdży- ok. 1 doby do momentu pojawienia się piany, rozpoczęcie fermentacji
2. okres niskich krążków- gromadzi się w aglomeraty, a częściowo wytrącające się żywice , zabarwiają się na brunatno
3. okres wysokich krążków- ok. 4-5 dnia wydzielanie CO2 jest największe, piana staje się lekka i wysoka
4. okres opadania krążków- drożdże opadają na dno, piana opada, tworzy się diacetyl- koniec fermentacji
5. leżakowanie młode „zielone” piwo pozostawia się w tankach leżakowych na 10 dni w temp. ok. -1,5°C, odprowadza się wtedy substancje lotne np. siarkowodór za pomocą przedmuchiwania CO2 .

Fermentacja leżakowa

W sumie cała fermentacja główna trwa 7-12 dni. Przebiega ona w temperaturze bardzo niskiej, wyjściowa temperatura fermentacji wynosi 5°C, po zakończeniu fermentacji wzrasta do 10°C. Młode piwo dojrzewa w procesie leżakowania. Młode piwo nie nadaje się jeszcze do konsumpcji ze względu na surowy, drożdżowy posmak. Zachodzą tu procesy:
• karbonizacja - nasycenie piwa CO2
• wytracenie drożdży w postaci osadu
Zachodzi ona w drzewianych kujach? o pojemności 20-60 hl lub metalowych tankach o poj. 500hl. Młode piwo zawiera jeszcze dość znaczna ilość drożdży i niewielką (resztkową) ilość cukru ok. 1%. Napowietrzanie piwa staje się impulsem do ożywienia działalności drożdży i podczas procesu leżakowania następuje wtórna fermentacja.

Tanki leżakowe

• maja aparaty czopowe regulujące poziom ciśnienia wewnątrz na poziomie 0,04 MPa
• zawartość CO2 powoduje pojawienie się piany podczas nalewania piwa
• liczne procesy chemiczne : utlenianie składników piwa, powstają estry (alk. etylowego, kw. węglowego) w związku z tym ze tych składników jest w piwie najwięcej. Tworzą się również aldehydy i połączenia aldehydowo-alkoholowe (acetale). Bukiet piwa : estry acetale i aldehydy

Dojrzewanie piwa

• 1-3 miesiące
• Obciąg piwa – do tanka doprowadza się górnym otworem sprzężone powietrza , względnie sprzężony CO2 , który powoduje wyciskanie piwa przez dolny otwór odprowadzający, zapobiega utracie CO2


Mieszanie i rozlew piwa

Piwa z kadzi leżakowych kierowanie jest pod lekkim nadciśnieniem do mieszalnika. Gdzie miesza się różne gatunki piwa z innych tanków. Piwo jest transportowanie a dział filtrów.

Filtracja - usuwa składniki, które nie opadły wraz z drożdżami

Etapy filtracji

1. Rozcieńczanie
2. Wymrażanie??
3. Sączenie
4. Filtracja
5. Karbonizacja
6. Przekazywanie piwa do tanków

Piwo- aspekt medyczny

Ekstrakt podstawowy od niego zależy zawartość alkoholu
Chmiel- działa uspokajająco
Słód węglowodany, zw. białkowe, mineralne, kw. organiczne i witaminy, 80% zw. fenolowych pochodzi ze słodu
• W 100g piwa znajduje się 4 g alkoholu
• W 92 wody na 100g piwa 0- gasi pragnienie
• 40 zw. węglowodanowych – łatwo przyswajalne
• Pokarm niskobiałkowy – zawiera wszystkie podstawowe aminokwasy
• Witamina B1,B2,B6 i H, a także B12, PP kw. foliowy B5
• Zwiększenie o 10-20% stężonych frakcji HOL we krwi (dobrego cholesterolu)
• Zwiększa ryzyko cukrzyce, chorób serca, zmniejsza objawy osteoporozy i ryzyka zapadalności na kamicę żółciową
• Jasne piwo jęczmienne jest źródłem krzemu w postaci kwasu ortokrzemowego
• Zawiera przeciwutleniacze: flawonoidy+ melanoidyny
• Piwo 200-240 kcal
• Bukiet piwa zależy od wielu czynników i nie jest stały


4 2012-06-20
Kapusta kiszona (kwaszona) – kiszeniu poddaje się poszatkowane liście kapusty, głównie białej (w niektórych regionach kraju – całe główki kapusty), dokładnie ubite (usunięcie powietrza, by stworzyć warunki beztlenowe), z dodatkiem soli kuchenne (2-3%) i dodatków smakowych (marchew, liście chrzanu, wiśni, dębu)
Znaczenie soli i dodatków przy kiszeniu kapusty. Sól ułatwia wydzielanie soku z poszatkowanej kapusty (na skutek cisnienia osmotycznego). Selekcjonuje obecne mikroorganizmy, ma wpływ na tworzenie smaku i zapachu produktu. Dodatki ułatwiają odpowiednio ukierunkować proces fermentacji, nadają odpowiedni smak i zapach taniny i fitoncydy z liści dębu, chrzanu czy czosnku selekcjonują mikroflorę.

Etapy fermentacji kapusty:
I 5-10dni (20st.C) – stopniowe obniżanie pH od obojętnego od 4,0; początkowo rozwój LAB i innej mikroflory (drożdże, coli, przetrwalnikujące tlenowce), później tylko LAB heterofermantatywnych (głównie Leuconostoc mesenteroides).
Następne 10-16 dni (kilkanaście st.C) – stopniowy spadek pH do 3,5; rozwój LAB heterofermentatywnych (głównie Lactobacillus plantarum, Lb. brevis) i pseudomlekowych (Pediococcus cerevisiae, później Lb. pentoaceticus) – obniżenie temperatury do 10st.C – dojrzewanie i przechowywanie i tworzenie cech sensorycznych.

Skład chemiczny kiszonej kapusty:
- kw mlekowy 1,5-1,8%
- kw octowy 0,3%
- etanol 0,4%
pH 3,4 – 3,5
Ześluzowacenie kiszonej kapusty – zbyt wysoka temperatura przechowywania(nadmierny rozwój Leuconostoc mesenteroides)

Ogórki kiszone (kwaszone)
Ogórki są kiszone w całości, po zalaniu roztworem soli – stężenie soli w solance zależy m.in. od masy ogórków, zazwyczaj ok. 8% NaCl (zawartość soli w soku i w ogórkach kiszonych powinna wynosić 2-3)

Dlaczego taka ilość soli potrzebna jest do kiszenia ogórków?
Ogórki zawierają dużo wody – powierzchnia ogórków jest silnie zanieczyszczona mikroflorą z gleby (mikroflory tlenowej może być 5x106 j.t.k./g. liczba Enterobacteriaceae – 1x106 j.t.k./g., pałeczek plekowych zaledwie 5x103 j.t.k./g.

Etapy fermentacji ogórków:
1. rozwój Enterobacter – wytwarzanie gazów (H2 i CO2)
2. wytwarzanie etanolu i CO2
3. Rozwój heterofermentatywnych LAB (najpierw Leuconosctoc mesenteroides, potem L.b. plantarum, L.b. brevis)
Cechy sensoryczne gotowego produktu zależą od przebiegu fermentacji (są kłopoty ze stosowaniem czystych kultur bakteryjnych).
Miękkie i puste przestrzenie w kiszonych ogórkach- na skutek rozwoju Bacillus (przetrwalnikujące, tlenowe, o zdolnościach rokładania związków pektynowych).


Korzyścią z kontrolowanej fermentacji mlekowej jest obniżanie poziomu azotanów V oraz biogennych amin w kiszonkach.

Aminy biogenne:
- wiele LAB wytwarza dekarboksylazę aminokwasową, która w warunkach beztlenowych powoduje powstawanie termostabilnych amin o nieprzyjemnym zapachu, m.in. tyraminy, histaminy, putrescyny, kadaweryny. Obecność tych biogennych amin uważany jest za przyczynę reakcji alergicznych lub zatruć pokarmowych u ludzi.
Wyselekcjonowane szczepy LAB stosowane jako składniki przemysłowych kultur startowych, charakteryzują się bardzo słabym lub brakiem wytwarzania amin biogennych.

PRODUKCJA WIN:
enologia (inos = wino + logos = nauka) – nauka traktująca o produkcji, pielęgnacji i rodzajach wina; obejmuje również zagadnienia chemii, mikrobiologii i analizy wina.
Wino to sfermentowany sok z winogron.
Proces winifikacji – przetwarzanie owoców winogron w wino. Najważniejszy etap to wydobycie i zachowanie maksimum smaku i zapachu, który zawiera skórka dojrzałych owoców.
2 podstawowe procesy wiwifikacji:
- winifikacja win czerwonych,
- winifikacja win białych.
Proces produkcji wina czerwonego:
zbiór → odszypułkowanie → gniecenie gron → dodawanie drożdży → wytłoczyny (moszcz) → maceracja i fermentacja skórek → oddzielenie wytłoczyn → starzenie w beczkach → klarowanie → filtracja → butelkowanie
Proces produkcji wina białego:
zbiór → gniecenie gron → wyciskanie moszczu → klarowanie → dodawanie drożdży → fermentacja → starzenie w beczkach → klarowanie i filtracja → butelkowanie
Klasyfikacja win w zależności od procesu ich wytwarzania i wykorzystania:
- pełne wytrawne,
- musujące,
- białe niedojrzewające w beczce,
- białe dojrzewające w beczce.
CUKIER:
Wina wytrawne → 0-10 g/dm3 cukru,
wina półwytrawne → 10-40 g/dm3,
wina półsłodkie →40-80 g/dm3,
wina słodkie → 80-120 g/dm3,
wina b. słodkie → 120-200 g/dm3,
wina likierowe →200-350 g/dm3.
ALKOHOL:
lekkie → do 10% obj. alkoholu,
średniomocne → 10-14% obj. alk.,
mocne → 14-18% obj. alk.,
alkoholizowane → powyżej 18% obj. alk.
wina wytrawne – fermentacja przebiegła do końca i cały cukier został przerobiony „wytrawiony” na alkohol.
wina słodkie – słodycz pochodzi z przerwanej fermentacji (zanim cały cukier zamieni się w alkohol)
Zawartość cukru w winogronach wynosi 20%.
Proces przerobu owoców zaczyna się od dokładnego umycia surowca w celu usunięcia z jego powierzchni różnych zanieczyszczeń, a przede wszystkim mikroflory towarzyszącej. Umyty surowiec następnie podlega rozdrobnieniu. Rozdrobniona miazga trafia na prasy (warstwowe lub hydrauliczne). Miazga owocowa układana jest warstwami w zasobniku, w którym następuje tłoczenie i przekładanie warstwami płótna. Po napełnieniu i uruchomieniu prasy następuje tłoczenie moszczu. Sok (moszcz) musi być poddany doprawianiu. W celu obniżenia kwasowości moszcz rozcieńcza się → obniżenie zawartości cukru. Cukry uzupełnia się dodając do moszczu sacharozę. Konsekwencją rozcieńczenia moszczu jest spadek zawartości związków azotowych. W celu uzupełnienia zw. azotowych dodaje się fosforan amonu – wzbogaca środowisko w połączenia fosforowe. Ilość związków azotowych 100-300 mg (0,1-0,3 g) na dm3 (litr) moszczu.
Moszcz wyciśnięty z owoców ma bogatą mikroflorę: drożdże dzikie Kloeckera apiculata i Schizosaccharomyces pombe oraz rodzaje Pichia i Candida. Bakterie: pałeczki Lactobacillus buchneri, bakterie fermentacji mlekowej i octowej. Grzyby nitkowate Mucor racemosus, Rhizopus stolonifer, Botrytis cinerea, Aspergillus (A. flavus, A. niger, A. glaucus) i Penicillium. Moszcz musi zostać zakonserwowany – siarkowanie czyli wprowadzanie bezwodnika kwasu siarkowego (SO¬2). Ta operacja ma na celu wyjałowienie moszczu i jego ochronę przed ciemnieniem. Stężenie bezwodnika 20 100 mg/l (siarkowanie=sulfitowanie=sulfitacja)
źródło siarki – bezwodnik, kwas siarkowy (IV), kwaśne siarczany (VI) 6% roztworu. Zakonserwowany moszcz należy odsiarkować przed fermentacją – desulfitacja. Polega ona na ogrzaniu moszczu kiedy to następuje ulatnianie się SO2. W winiarstwie stosuje się rasy drożdży oporne na SO¬2.
Winiarstwo gronowe może korzystać z dzikiej mikroflory, natomiast winiarstwo owocowe korzysta z czystych ras drożdży winiarskich – wyższość fermentacji prowadzonych przy użyciu czystych kultur. Drożdże dzikie mogą wytwarzać mniej alkoholu (5-10%), wykazują wyższą zawartość kw. lotnych i czasem niezbyt cenione odcienie smakowo-zapachowe w nim. Czyste kultury ras drożdży winiarskich przystosowane są do specjalnych warunków panujących w moszczu. Pozwalają one na uzyskanie większej zawartości alkoholu (15-17%) i lepszych cech organoleptycznych.
Drożdże winiarskie należą do gatunku Saccharomyces cerevisiae fermentacji dolnej. Charakteryzują się dość dużym odfermentowaniem moszczu (do 18% alkoholu), opornością na SO2 i garbniki, pracą w znaczniejszych stężeniach alkoholu i w środowiskach silnie zakwaszonych oraz zdolnością do osadzania się (koagulacji) na dnie po fermentacji (klarowanie wina). Drożdże winiarskie mają zdolność (w pewnym stopniu) wytwarzania oprócz alkoholu również innych związków. Obecność tych związków przyczynia się do nadawania winu tzw. bukietu, czyli lepszych cech organoleptycznych takich jak smak, zapach, barwa, zawartość alkoholu itp..
Do bardziej znanych ras (szczepów, odmian fizjologicznych) drożdży winiarskich można zaliczyć: Tokay, Sherry, Malaga, Madeira, Riesling, Bordeaux i Sauterne. Ich nazwy utworzono od nazw winnic i miejscowości, gdzie dane wina są produkowane. Rasy te różnią się między sobą wielkością komórek, ilością wytwarzanych i zużywanych kwasów organicznych, procentową ilością wytwarzanego alkoholu, wytrzymałością na różne stężenia cukru, sposobem osadzania się na dnie naczyń po fermentacji, wpływają one na bukiet wina.
Na bukiet wina wpływa głównie gatunek owocu, sposób doprawiania moszczu i proces kupażowania czyli mieszania win. Optimum temperatury dla rozwoju większości ras ok. 25°C, 10-15°C – rasy kriofilne, do 30°C – drożdże do produkcji win o dużym stężeniu alkoholu.
W ostatnich latach prowadzi się prace nad ulepszaniem drożdży na drodze mutagenizacji – otrzymanie drożdży osmofilnych, alkoholoopornych o podwyższonej ekspresji genów maltozowych, dzięki przeniesieniu genów dekstrynaz uzyskano drożdże zdolne do bezpośredniej hydrolizy i fermentacji skrobii.
Ekspresja genów typu killer – białka toksyczne dla innych grup mikroorganizmów, selektywna funkcja w stosunku do niepożądanej mikroflory naturalnych moszczów zastępuje stosowany dotychczas kwas siarkowy.
Doprawiony, przygotowany do fermentacji moszcz zaszczepia się drożdżami winiarskimi (matką drożdżową). Inokulum szczepienne wyprowadza się stopniowo tzn. kulturę, która jest przechowywana w skosie agaru brzęczkowego przeszczepia się na początkowo niewielką ilość (100 cm3) wyjałowionego w kolbie moszczu.
Moszcz uzupełniany jest dodatkiem substancji pobudzających drożdże (fosforan amonu). Hodowle drożdży prowadzi się 36-48 godzin w temp. 28-30°C na wytrząsarce. Dalej powiększa się skalę hodowli tj. 100 cm3 matki służy do zaszczepienia moszczu o obj. 2dm3(l), który służy jako inokulum do zaszczepienia poj.50l => 1000 l (spora beczka).
Propagatory- urządzenia służące do rozmnażania matki drożdżowej w większych ilościach, a więc takich jakie się stosuje do zaszczepienia kadzi fermentacyjnych. Propagatory napowietrzają moszcz. Ilość matki drożdżowej w stosunku do doprawionego moszczu może się wahać od 1 – 5% tzn. na każde 100 l moszczu daje się 1-5 litrów matki.
Fermentacje moszczu prowadzi się w kadziach fermentacyjnych, które wypełnione są w ¾ swojej objętości. 2 fazy fermentacyjne : ferm. burzliwa i potem etap dojrzewania wina.
3 podetapy: zafermentowanie, fermentacja główna, dofermentowanie.
Zaferementowanie-przewaga procesów rozmnażania drożdży, alkohol jest wolniej nagromadzany. W miarę rozwoju drożdży i wyczerpywania tlenu rozpuszczonego w moszczu tempo namnażania słabnie. Z chwilą kiedy poziom stężenia alkoholu osiągnie 5% procesy namnażania w ogóle zanikają a ożywia się działalność fermentacyjna drożdży.
Etap fermentacji burzliwej lub głównej-charakteryzuje się on energicznym przerabianiem przez drożdże cukrów na alkohol etylowy i CO2, przy czym ustaje zupełnie namnażanie drożdży. Procesom tym towarzyszy intensywne burzenie płynu. W miarę upływu czasu nasilenie procesów słabnie, co uwidacznia się tworzeniem piany. Wzrasta natomiast zawartość alkoholu osiągając odpowiedni poziom.
Dofermentowanie - fermentacja cicha, zanik aktywności fermentacyjnej drożdży, które zaczynają opadać i osadzać się na dnie. Wraz z drożdżami do osadu spadają błonnik, pektyny, substancje białkowe i koloidalne. W tym okresie następuje powolny rozkład resztek cukrów i wstępne klarowanie moszczu.
2 tygodnie – okres ten zależy od temp i w wyższym ich zakresie szybciej przebiega.
Wino oddziela się w sposób łagodny, aby nie spowodować naruszenia osadu tzn. nie spowodować ponownego zmętnienia.
Ściągnięte znad osadu młode wino podlega procesowi dojrzewania (leżakowania, fermentacji wtórnej), a więc wchodzi w drugą fazę produkcyjną, która jest znacznie dłuższa. Młode wino nie jest sklarowane, zawiera zbyt dużo CO2 i jego smak nie jest do końca zharmonizowany – zbyt surowy. To zostaje skorygowane w procesie leżakowania (nabranie odpowiednich cech organoleptycznych) czyli tego co określa się jako bukiet.
Leżakowanie- w kadziach, temp rzędu 5-12 st. C, warunki beztlenowe w celu zabezpieczenia wina przed możliwością wystąpienia infekcji przez drobnoustroje tlenowe, które mogą powodować zagrożenie. Zachodzą istotne procesy biochemiczne – powstają estry, związki ketonowe i acetale (alkoholo+aldehyd)- cechy organoleptyczne. W tym czasie odbywa się redukcja kwasów do aldehydów. Dojrzewanie wina trwa kilka miesięcy do kilku lat.
Wykańczanie wina – przefiltrowane, zmieszane z innymi partiami tego samego typu wina (kupażowanie). Wyeliminowanie różnic w partiach wina dotyczących smaku, zapachu, kwasowości itp., a więc uzyskanie produktu i oczekiwanej jakości.
Kwasowość – dodatek kw winowego lub cytrynowego.
Rozlew do beczek lub butelek i utrwalanie wina, pasteryzacja.
Szkodniki:
Pichta, Candida valida, drożdże rozszczepkowe, Schizosacharomyces pombe, bakterie octowe – utlenianie etanolu do kwasu octowego, kwaśnienie wina, bakterie fermentacji mannitowej-odkwaszanie wina, bakterie fermentacji mlekowej.
Flawonoidy – kwercetyna, katechina – przeciwutleniacze chroniące DNA i niszczące wolne rodniki.
Szampan – sklarowane i nasycone CO2 wino
szampanizacja – przebiega w 12-15 st. C wewnątrz butelek, wytworzony CO2 nasyca wino. Czas trwania fermentacji 40-50 dni.
System szampanizacji zbiornikowej – proces wtórnej fermentacji przeprowadza się w szczelnie zamkniętych zasobnikach, gdzie następuje wysycenie CO2. Po zakończeniu tego procesu, drożdże opadają na dno.
Trzy szczepy winogron – Pinot noir, Pinot Mounier, i??????
Wina gronowe – sztucznie nasycone sprężonym CO2, nie są otrzymywane na drodze naturalnej poprzez fermentacje wtórną.
Wermuty – produkowane są z win doprawionych ziołami aromatycznymi i często jeszcze uzupełniane cukrem i wzmacniane alkoholem.


Miód pitny:
nienasycony – powstaje z zimnej mieszanki miodu pszczelego z wodą (najlepiej miód lipowy)
nasycony – gotowanie tej mieszanki, co uwalnia napój od mikroorganizmów
Pitny miód powstaje dzięki fermentacji rozpuszczonego w wodzie miodu pszczelego z dodakiem chmielu, niekiedy też drożdży i przypraw. W zależności od dodatków powstały: deseniaki, maliniaki, wiśniaki.
W zależności od proporcji miodu do wody:
-półtoraki 2:1
-dwójniaki 1:1
-trójniaki 1:2
-czwórniaki 1:3
-piątaki 1:4
-szóstaki 1:5
Najtrudniej jest otrzymać miody z brzeczek najbardziej zagęszczonych, a więc półtoraki i dwójniaki. W tym przypadku brzeczka miodowa jest na tyle gęsta (duże ciśnienie osmotyczne), że trzeba stosować drożdże osmofilne (Zygosacharomyces rouxi, Z.mellis) które są w stanie odfermentować taką brzeczkę.
Dębniak – pitny miód, wytrawny, wyjątkowo aromatyczny.
popielaki – wszystkie stare wina
Miód pitny podaje się w temperaturze pokojowej, w zimie jako grzaniec z dodatkiem przypraw korzennych. Przechowuje się w ciemnym i chłodnym miejscu.

3 2012-06-20
DEKSTRAN – PRODUKCJA I ZASTOSOWANIE:
Dekstran jest polisacharydem zbudowanym z glukozy połączonej wiązaniami α-(1-6)-D-glikozydowymi.
Między resztami glukozowymi są wiązania α-(1-4)- i α-(1-3)-D-glikozydowe, tworzące „łańcuchy” boczne.
Wiązania α-(1-6)-D-glikozydowe stanowią 90-95% wiązań glikozydowych w dekstranie, chociaż występuje również dekstran, w którym wiązania α-(1-6)- stanowią poniżej 50%.
- masa cząsteczkowa dekstranu wynosi od 5 x 104 – 3 x 108 Da.
- jest jasnożółtym lub białym proszkiem,
- w wodzie tworzy roztwór koloidalny o różnej lepkości, zależnie od ilości i stosunku między wiązaniami α-(1-6)-, α-(1-4)- i α-(1-3)-D-glikozydowymi,
- w technologii żywności może być stosowany jako zagęstnik, dzięki któremu można uzyskać półstałą konsystencję produktów,
Dotychczas dekstran nie jest dopuszczony jako dodatek do żywności (ang. food additive), chociaż opatentowano wiele możliwości zastosowania dekstranu.
Bakterie zasiedlające jelita człowieka i zwierząt są zdolne do rozkładu dekstranu, co powoduje szybki wzrost zawartości cukru we krwi oraz glikogenu w wątrobie (niewydalony dekstran jest metabolizowany w wątrobie do CO2 i wody).
Dekstran jest polecany jako bezpieczny biodegradowalny składnik opakowań dla żywności.
W 1942 r. Szwed Ingelman zaproponował użycie hydrolizatu dekstranu jako zmiennika plazmy krwi.
Obecnie dekstran o masie cząsteczkowej 70 000 i 40 000 jest stosowany w medycynie, zwłaszcza po urazach chirurgicznych.
Od 1959 r. dekstran jest również używany do produkcji żeli Sephadex, co przyczyniło się do znacznego postępu w analityce i technikach rozdziału substancji.
Do produkcji dekstranu na skalę przemysłową, w większości krajów używa się szczepu Leuconostoc mesenteroides NRRL B12(F) lub Leuconostoc mesenteroides B512.
Dekstran wytwarzany jest z glukozy podczas hydrolizy sacharozy za pośrednictwem enzymu zwanego dekstranosacharozą lub sacharozą dekstranową. Jest to pozakomórkowa glukozylotransferaza wytwarzana przez heterofermentatywne ziarniaki mlekowe z gatunku Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. Jest to osławiona „bakteria żabiego skrzeku” występująca w cukrowniach, gdzie została opisana po raz pierwszy w 1878 r. przez Polaka Leona Cieńkowskiego. Bakteria ta powoduje w krótkim czasie zamianę roztworów cukru (soków owocowych) w galaretę złożoną z dekstranów.
Praktyczne zastosowanie dekstranu jest wielorakie, ale najważniejsze zastosowanie znalazł on obecnie w lecznictwie, jako środek zastępujący osocze krwi. Poza tym mniejsze jego znaczenie praktyczne dotyczy wykorzystania go (głównie ze względu na jego dużą lepkość i właściwości emulgujące) jako środka zastępującego gumy i śluzy roślinne, np. do klejenia apretury w drukarstwie w tym także przy produkcji tkanin drukowanych. W niewielkim zakresie jest używany przy wyrobie papieru oraz w niektórych działach przemysłów spożywczych. W tych ostatnich służy m.in. jako stabilizator w procesie produkcji syropów cukrowych, lodów i innych wyrobów cukierniczych.
29 marca:
Synteza dekstranu:
nC12H22O11 + H2O (C6H12O6 – H2O)n + n-fruktoza (C6H10O5)n
Przebieg biosyntezy dekstranu:
1) nagromadzenie enzymu dekstranosacharazy
2) konwersja sacharozy do dekstranu
- początkowe pH pożywki 6,7-7,2 w marę trwania hodowli obniża się do 6,4-6,9. Wówczas obserwuje się syntezę enzymu dekstranosacharazy (najintensywniej w pH 6,7),
- konwersja do dekstranu najintensywniej zachodzi przy pH 5,2,
- duże znaczenie ma zawartość sacharozy w podłożu, która powinna być większa od 2%. Dlatego podczas hodowli ciągłej stosuje się zasilanie hodowli sacharozą.
Etapy produkcji dekstranu:
1.) wyprowadzenie kultury zarodowej:
- surowcem wyjściowym, który służy do produkcji dekstranu jest sacharoza w stężeniu 10-15%. Ponadto konieczny jest dodatek do pożywki określonych składników pokarmowych. Oprócz soli mineralnych odżywczych (fosforany, siarczan magnezu, chlorek sodu) podłoża te mogą być uzupełnione odpowiednim dodatkiem mikroelementów, witamin i substancji wzrostowych, np. autolizat drożdżowy, wyciąg z kiełków słodowych, namok z kukurydzy, wyciąg z pomidorów. Podłoża przygotowane w ten sposób poddaje się dokładnej sterylizacji i do wyjałowionych podłoży wprowadza się przygotowaną wcześniej szczepionkę bakterii Leuconostoc mesenteroides, która tutaj musi być użyta w ilości 5% w stosunku do przygotowanego podłoża. Fermentacja trwa 2-6 dni w temp. 20-25°C. Po zakończeniu fermentacji bakterie usuwa się z roztworu pofermentacyjnego przez odwirowanie. Z klarownego płynu wytrąca się dekstran przez działanie alkoholem, przy czym może być użyty zarówno alkohol etylowy, jak i metylowy. Stosuje się go w ilości 1:1 – na każdą objętość przefermentowanego podłoża daje się taką samą objętość alkoholu. W tych warunkach dekstran wypada w postaci białego (mlecznego) gąbczastego osadu (masy), którą oddziela się od roztworu.
2.) hydroliza dekstranu:
- dekstran musi być łagodnie zhydrolizowany tak, aby uzyskać odpowiednią masę jednostkową jego cząsteczek. Hydroliza przebiega przy udziale słabych roztworów kwasu solnego na drodze termicznej – przez działanie podwyższoną temperaturą. Można ten proces też przeprowadzić na drodze enzymatycznej, działając na dekstran enzymem dekstranazą (typu endo), który powoduje rozrywanie długich łańcuchów dekstranu na krótsze. W przypadku dekstranu, który ma być przeznaczony dla celów medycznych – wielkość cząsteczek ok. 75 kDa. Po przeprowadzeniu tej łagodnej hydrolizy, dekstran ponownie wytrąca się przez zadziałanie alkoholem.
3.) oczyszczanie dekstranu:
- przez rozp. w wodzie można traktować dekstran węglem aktywnym lub ziemią okrzemkową, traktowanie wymieniaczami jonowymi – oddzielenie od występujących zanieczyszczeń.
4.) oczyszczony dekstran poddawany jest zagęszczeniu w warunkach zabezpieczających możliwość jego rozkładu.
5.) po zagęszczeniu poddaje się go procesowi suszenia w suszarkach rozpyłowych.

Dekstran wysuszony w postaci sproszkowanej może być kierowany do sprzedaży. Jeśli jest rozprowadzany jako lek (dla celów służby zdrowia) – 6% roztwór w soli fizjologicznej.
Oprócz metody fermentacyjnej opartej na wykorzystaniu kom. bakteryjnych, dekstran można produkować metodą enzymatyczną, w której w miejsce bakterii wykorzystuje się produkowany przez nie zewnątrzkomórkowo enzym – dekstranosacharazę.
Produkcja dekstranu metodą fermentacyjną w Polsce – Kutno, zakłady podległe Zjednoczeniu Polfa.

FERMENTOWANE NAPOJE MLECZNE
Mleko:
- mleko odtłuszczone zawiera tyle samo białka, wapnia i witaminy B, co mleko pełne, ale mniej witamin A, D i E rozpuszczonych w tłuszczach. O różnicach między gatunkami mleka decyduje zawartość tłuszczu.
- najważniejsze, najtańsze i najkorzystniejsze źródło łatwo przyswajalnego wapnia,
- zawiera wszystkie niezbędne aminokwasy,
- tłuszcz 1,5-2% - choroba niedokrwienna serca, miażdżyca, nowotwory 3,2-3,5% - dzieci i młodzież.
- cukier mleczny 4-5%, korzystny wpływ na bioprzyswajalność wapnia, główne źródło węgla, prawidłowa flora bakteryjna jelita grubego.
- witamina A – konieczna do prawidłowego wzrostu i rozwoju nabłonka, podwyższa odporność błon śluzowych, rola w przystosowaniu oczu do widzenia przy słabym oświetleniu; niedobór lub brak: kurza ślepota, pieczenie spojówek na skutek ich wysychania i rogowacenia, rozmiękanie i owrzodzenie rogówki, rogowacenie skóry, wypadanie włosów.
- witamina B2 (ryboflawina) – zawarta w koenzymach biorących udział w przemianie glukozy i aminokwasów.
- witamina D – gospodarka wapniowa i fosforowa; niedobór: krzywica, utrata zębów.
- mleko zawiera tylko niewielkie ilości żelaza, nie zawiera wit. C i błonnika pokarmowego.
Produkty: zsiadłe mleko, kefir, jogurt, huślanka, kumys, leben, maślanka, serwatka.

WYKŁAD 12.04:
Obecnie do fermentacji mlekowej stosowane są szczepy bakterii wyizolowane z mikroflory jelitowej zdrowych ludzi (Bifidobacterium sp. – wytwarza bakteriocynę o nazwie bifidyny, Lactobacillus acidophilus, L. casei – wytwarza bakteriocynę o nazwie kazeicyny); wyroby wytworzone tą metodą nazywane są „produktami mlecznymi trzeciej generacji” (I generacja to wyroby tradycyjne oparte o samofermentację, II generacja to wyroby oparte o czyste kultury tradycyjnych bakterii kwasu mlekowego). Wolumen ich sprzedaży stale rośnie, nowe produkty stanowią obecnie 25% sprzedanych wyrobów mlecznych w Szwecji i Japonii.

PROBIOTYKI
Żywe organizmy, które po spożyciu wywierają korzystny wpływ na organizm gospodarza poprzez poprawę równowagi mikroflory jelitowej.

Cechy idealnego probiotyku:
• ludzkie pochodzenie
• oporność na działanie kwasu solnego i żółci
• zdolność przylegania do nabłonka jelita człowieka
• zdolność kolonizacji przewodu pokarmowego
• produkcja substancji przeciwdrobnoustrojowych
• korzystne oddziaływanie na zdrowie człowieka
• bezpieczeństwo stosowania

Szczepy o udokumentowanych cechach probiotycznych:
(tabelka z której niestety nic nie da się rozczytać )

PREBIOTYKI
Nie podlegające trawieniu składniki pożywienia, które selektywnie pobudzają wzrost lub aktywność wybranych szczepów bakterii jelitowych, a poprzez korzystną zmianę jej składu wpływają na poprawę stanu zdrowia gospodarza.

Kryteria jakie muszą spełniać produkty prebiotyczne:
• jest to związek chemiczny lub środek spożywczy modyfikujący środowisko przewodu pokarmowego by ułatwiać namnażania pożytecznych składników flory jelitowej
• prebiotyki są to nietrafione oligosacharydy, które fermentują w jelicie grubym
• stosowany łącznie z probiotykiem – daje właściwy efekt
• przykłady: inulina, -glukany (produkty hydrolizy skrobii), fruktooligosacharydy, galaktooligosacharydy, ksyloologosacharydy, izomaltooligosacharydy, oligosacharydy sojowe, fosfooligosachrydy FOS.
• Nie mogą być hydrolizowane, ani wchłaniane w górnych odcinkach przewodu pokarmowego
• Muszą podlegać selektywnej fermentacji przez potencjalnie korzystne bakterie bytujące w jelicie grubym
• Muszą korzystnie modyfikować układ mikroflory jelita grubego
• Uzyskany efekt musi być korzystny dla zdrowia gospodarza






Interakcje między probiotykami, prebiotykami i mikroflorą w przewodzie pokarmowym:

Prebiotyki Probiotyki
Substraty bakterie fermentacji mlekowej




Skład Aktywność
Mikroflory mikroflory

Dominujące mikroorganizmy w jelicie człowieka:

(TABELKA)

W 1 gramie treści jelita grubego znajduje się do ok. 1 000 000 000 000 komórek mikroorganizmów reprezentujących ponad 400-500 różnych gatunków. Łącznie biomasa mikroorganizmów zasiedlających przewód pokarmowy wynosi 1-1,5 kg.

Aktywność antagonistyczna bakterii fermentacji mlekowej:

(TABELKA)

Odżywcze i terapeutyczne aspekty bakterii mlekowych

Korzyści odżywcze:
1. Kwas mlekowy:
- zwiększa strawność białek mleka poprzez precypitację ich do cząsteczek sernika
- zwiększenie strawności i resorpcji w przewodzie pokarmowym
- polepsza wykorzystanie wapnia, fosforu i żelaza, związane z wydzielaniem większej ilości kwasu solnego w żołądku, co warunkuje wchłanialność tych pierwiastków
- stymuluje wydzielanie soków żołądkowych, śliny, żółci
- przyspiesza przepływ treści żołądka
- służy jako źródło energii w procesie oddychania
2. Synteza witamin z grupy B
3. Enzymy lipolityczne bakterii uwalniają z tłuszczu mlecznego kwasy tłuszczowe, co zwiększa jego strawność i wchłanialność

Korzyści terapeutyczne:
1. złe trawienie laktozy: laktoza jest niepożądana w diecie osób mających niedostateczny poziom laktozy w jelicie cienkim. Napoje fermentowane zawierają 26-50% laktozy mniej niż mleko, co wpływa na osłabienie objawów nietolerancji,
2. Hiperchlesterolemia: emulsyfikacja tłuszczów diety jest procesem pośrednim w absorpcji tłuszczu. Sole żółciowe wraz z fosfolipidami i cholesterolem tworzą micele, które pomagają w adsorpcji cholesterolu. Bakterie mlekowe dekonjugują sole żółciowe do kwasów żółciowych, co hamuje powstawanie miceli i obniżenie adsorpcji cholesterolu.
3. Rakotwórczość: LAB mogą hamować rozwój mikroflory feralnej z rodzaju Clostridium, Staphylococcus, Peptostreptococcus, która wytwarza tzw. enzymy feralne: glukoronidazy, nitroreduktazy, azoreduktazy, przekształcające komórki prokancerogenne do karcynogenów.
- LAB mają zdolność do biodegradacji azotynów, co zmniejsza ryzyko powstania nitrozoamin,
- żywe komórki L. acidophilus, L. casei, L. delbruecki, L. bulgaricus zwiększają zdolność makrofagów do fagocytowania komórek nowotworowych
4. Stymulacja systemu odpornościowego, niektóre LAB np.: L. acidophilus, L. brevis, Bifidobacterium pośrednio wpływają na produkcję INF-γ
5. Wpływ LAB na kształtowanie mikroflory narządów moczowo-płciowych kobiet


Bakterie pomogą ci schudnąć!!!!

Otyłość mogą wywoływać bakterie, które żyją w naszym przewodzie pokarmowym. Wystarczy, że po tłustym posiłku wypijesz jogurt a nie będzie problemu z kaloriami.
Ostatnio naukowcy z Washington University w Missouri, którzy pracują już nad tym jak unieszkodliwić groźne mikroorganizmy, wykazali, że rodzaj bakterii żyjących w naszych jelitach zmienia się w zależności od diety. Najgroźniejsze są te, które powstają po zjedzeniu Fast-foodów – wpływają na metabolizm i zwiększają produkcję tłuszczu w organizmie.

W czasie eksperymentu na amerykańskim uniwersytecie pobrano bakterie z żołądka myszy odżywianych tłustym, niezdrowym pokarmem. Potem wprowadzono je do organizmów gryzoni, które karmiono niskokaloryczną żywnością. Mimo, że ich dieta się nie zmieniła, szybko przybrały na wadze.
Naukowcy chcą więc skorzystać z tej prawidłowości. Metodą, która pomoże w walce z nadwagą w naszym organizmie.
Najlepszym sposobem na zniszczenie tych szkodliwych mikroorganizmów jest wprowadzenie do jelita innych bakterii, które zahamują przyrost wagi ciała.
Bakterie nie wpływająca na wagą mogą być dodawane do jogurtów, napojów i żywności.

Mikrobiom jelit a otyłość
Liczba ludzi otyłych dramatycznie wzrasta USA 62% populacji z nadwagą a 32% jest otyła. Liczba otyłych dzieci w USA ulagła potrojeniu od 1980 roku.
Otyłość powiązana z chorobami metabolicznymi jak np. cukrzyca typu 2, chorobami układu krążenia, bezdechem sennym.

Mikrobiom jelit a procesy chorobowe
Choroby zwią znae ze zmianami w składzie mikroflory jelit:
- choroby IHD
- choroba Cohna (CD), wrzodziejąca zapalenie okrężnicy (IC)
- choroby nowotworowe np. nowotwory jelita grubego, przełyku
- cukrzyca typu 2
- alergie
- choroby układu krążenia (poziom cholesterolu regulowany przez sole żółciowe).

Wykorzystanie fermentacji mlekowej w maślarstwie
Bakterie fermentacji mlekowej wykorzystane zostały do ukwaszania śmietany. Kiedyś nie znano innego sposobu wydzielania smietany, jak tylko takiego, że trzeba było mleko pozostawić w chłodnym miejscy w spokoju na pewien okres czasu. Wtedy samoczynnie tłuszcz oddziela się od pozostałej zawiesiny. Ten okres czasu był jednak wystarczający, aby można było uzyskać śmietanę ukwaszoną. Masło wytwarzane z takiej śmietany charakteryzuje się określonym smakiem, do którego ludzie przyzwyczaili się od czasów niepamiętnych i dlatego dzisiaj, chociaż nie musimy czekać w celu oddzielenia śmietany ani chwili albo tylko bardzo małą chwilę (w mleczarni można tłuszcz oddzielić natychmiast przez odwirowanie i uzyskujemy w ten sposób słodką śmietankę), uzyskaną słodką śmietankę ukwaszamy.
Masło uzyskane z słodkiej śmietanki nie ma charakterystycznych cech smakowych i wobec tego przed przerobieniem śmietany na masło w maślarni podlega ono ukwaszeniu. W tym celu stosuje się obecnie wyselekcjonowane kultury mleczarskie tzw. zakwas mleczarski, który składa się z określonych czystych ras bakterii. Zakwas ten jest dodawany do śmietany w postaci szczepionek płynnych lub sproszkowanych, które zawierają wyłącznie ziarniaki mlekowe. Tutaj warto dodać, że oprócz tych elementów organoleptycznych, o których mówiłem [:)] ukwaszenie śmietany daje jeszcze pewne dodatkowe wartości technologiczne. Po pierwsze zapobiega rozwojowi szkodników rozkładających białko i ewentualnie tłuszcz. Po drugie obniżenie pH śmietany wpływa również korzystnie na proces zmaślania tłuszczu mlecznego.
Do procesu ukwaszania śmietany nie używamy bynajmniej jakby można sądzić, z pozoru bakterii biofermentacji mlekowej. Nie chodzi tutaj bowiem tylko o uzyskanie efektu zakwaszenia. Tutaj oprócz podkwaszenia ważne jest aby uzyskać pewne cenne również walory zapachowe, a te związane są z wytwarzaniem diacetylu, który powstaje w skutek utleniania acetylometylokarbinolu (czyli inaczej mówiąc acetony). Właściwość wytwarzania tego składnika mają niektóre ziarniaki mlekowe, takie, jak: Leuconostoc mesenteroides subsp. Cremoris i destranicum (?). One też często są używane w charakterze zakwasu mleczarskiego, zwykle łącznie z Lactococus lactis subsp. lactis i cremoris, dzięki czemu uzyskuje się z jednej strony zakwaszenie środowiska zaś z drugiej strony wytwarzanie substancji aromatycznych.
Diacetyl nadaje masłu pożądany „orzechowy” albo wg innych „migdałowy” zapach. Te kultury mieszane mogą być zastąpione przez użycie jednej tylko jednej (!) homofermentatywnej kultury Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis.
Paciorkowiec ten – kwasząco-aromatyzujący – jest zdolny równocześnie do ukwaszania i do tworzenia aromatu, a więc ukwaszania i do tworzenia aromatu, a więc diacetylu, który nadaje masłu pożądany, orzechowo-migdałowy zapach.
Uzyskany dojrzały zakwas służy czesiowo do przygotowania następnej takiej porcji inoculum na dzień następny tzn. część tego zakwasu odlewa się i zaszczepia wypasteryzowaną śmietanką, a pozostała ilość służy do ukwaszania śmietany przeznaczonej na przerób na masło.
Po wprowadzeniu tego zakwasu mleczarskiego do śmietany przetrzymuje się ją w temperaturze 17-20 st. C w ciągu ok. 20h. Po tym czasie śmietana jest już dostatecznie ukwaszona i aromatyzowana i kieruje się ją do zmaślenia.

Przemysł serowarski
Produkcja serów polega na wytrąceniu kazeiny z mleka, oddzieleniu serwatki i dojrzewaniu masy serowej pod wpływem działania enzymów drobnoustrojów.
Wyróżniamy sery:
* podpuszczkowe:
- twarde (prasowane) np. holenderski, szwajcarski
- miękkie (nieprasowane) np. camembert, limburger, brie, bryndza
* twarogowe
* topione
* serwatkowe
* wysuszone np. ziołowe

Sery są produktem mlecznym uzyskanym z mleka pełnego, odtłuszczonego lub ich mieszaniny. Produkuje się je głównie z mleka krowiego, rzadziej z mleka owczego i koziego. U podstaw wyrobów sera leży otrzymywanie i odpowiednia mechaniczno-termiczna obróbka skrzepu mleka – kazeina, która koaguluje pod wpływem działania:
- podpuszczki – preparatu enzymatycznego (sery podpuszczkowe)
- zakwaszania do pH odpowiadającego wartości jej punktu izoelektrycznego (sery twarogowe)
- obydwu tych czynników łącznie (np. twarożki homogenizowane lub „Cottage Cheese”)

W Polsce pod względem zawartości tłuszczu sery dzielę się na:
- śmietankowe (ok. 50%)
- pełnotłuste (nie mniej niż 45%)
- tłuste (40%)
- półtłuste (nie mniej niż 20%)
- chude (mniej niż 10%)

Pod względem zawartości tłuszczu, sery dzielą się na:
-śmietankowe (około 50%)
- podpuszczkowe (nie mniej niż 45%)
- tłuste (45%)
- półtłuste (nie mniej niż 20%)
- chude (mniej niż 10%)
Konsystencja serów jest uzależniona od zawartości w nich wody oraz od procesu technologicznego, jakiemu masa serowa jest poddawana i dzielą się one na:
-twarde
-miękkie.

Ze względu na technologię produkcji dzielą się na:
-świeże (biały ser, mascarpone, feta, mozzarella)
- gotowane
- fermentowane:
- podpuszczkowe, miekkie, dojrzewające ze skórką pleśniową (camembert, brie)
- twarde dojrzewające (ementaler, parmezan)
- półtwarde (cheddar, Edam, gouda)
- pleśniowe (roquefort, gorgonzola).

Proces produkcji zapoczątkowany jest przez podpuszczkę, może być stosowana cielęca (otrzymywana z błon śluzowych żołądków cielęcych), mikrobiologiczna (szczepy bakterii) lub genetycznie modyfikowana (organizm zmodyfikowany genetycznie produkuje enzym). W wyniku działania podpuszczki dochodzi do wytrącenia kazeiny z mleka w postaci skrzepu, z którego wytwarza się następnie masę serową, która po uformowaniu, wyprasowaniu i wysoleniu poddawana jest procesowi dojrzewania, co nie dotyczy serów świeżych. W czasie dojrzewania sera tworzy się w nim kwas mlekowy, a następnie występuje rozkład białek i tłuszczów z tworzeniem się substancji nadających charakterystyczny smak i zapach. Powstające gazy, głównie dwutlenek węgla, tworzą oka (dziury) wewnątrz sera.

Ze względu na charakterystyki smakowe, sery mogą być słodkie, słodkie, słone, pikantne, ostre, łagodne, ziołowe itd. Dodatkowe sery mogą być poddawane procesowi wędzenia i innym rodzajem obróbki. Technologią produkcji serów zajmuje się serowarstwo.

Sery topione produkuje się natomiast topiąc jeden lub więcej rodzajów sera twardego z dodatkiem masła, mleka lub śmietany i specjalnych topników.

Wartości odżywcze i wskazania dietetyczne
Sery jako pochodne mleka, są ważnym źródłem wapnia (w jednym plastrze zawarte jest ok. 160-200mg) oraz białka i witaminę B12, ponadto są kaloryczne, a ich wartość odżywcza wynosi 300-500kcal/100g. W produktach serowarskich występują obficie tłuszcze i cholesterol, dlatego nadwaga, choroby układu krążenia, w tym nadciśnienie tętnicze, są przeciwwskazaniami do spożywania serów. W takim przypadku polecane są pacjentom sery kozie, o mniejszej zawartości tłuszczów.
Mleko krowie i jego przetwory mogą być czynnikiem alergizującym.

Przemysł owocowo-warzywny
Kultury bakterii mlekowych, stosowane w przemyśle owocowo-warzywnym są głównie wykorzystywane w kiszeniu warzyw, chociaż w kuchni staropolskiej kiszono również niektóre owoce (jabłka, śliwki).
Ich zastosowanie gwarantuje otrzymywanie produktów o wysokiej wartości odżywczej (wysokiej zawartości witamin i składników mineralnych) – powtarzalnych cechach sensorycznych (nowy rodzaj produktu).
Poza zahamowaniem rozwoju lub zniszczeniem drobnoustrojów niepożądanych, również jest ważne:
1. Zahamowanie procesów oddechowych w tkankach
2. Zahamowanie enzymatycznych oksydacyjnych procesów tkankowych, powodujących np. utlenienie się witaminy C lub brunatnienie powierzchniowe
3. Zahamowanie hydrolitycznych procesów enzymatycznych, będących powodem nadmiernego mięknienia, rozpadu tkanek i niepożądanych zmian smakowo-zapachowych.

2 2012-06-20
Do pośrednich szkodników octownictwa należą niektóre owady, tj. muszki octowe – czerwono
brunatne – Drosophila fenestrarum (długość ciała 2,5 – 3 mm) właściwa muszka octowa oraz
ciemno – brązowa, większa o 1 mm od poprzedniej Drosophia funebris dla której właściwym
środowiskiem są gnijące lub spleśniałe podłoża organiczne. Głównymi miejscami wylęgania się
muszek Drosophila fenestrarum są resztki słodkich cieczy ulegających fermentacji alkoholowej,
fermantujące owoce a także fermentory powierzchniowe i ociekowe.
Muszki octowe nie są bezpośrednimi szkodnikami w octownictwie, ale mogą być one nosicielami
bakterii nadoctujących i z tego względu ich obecność w octowniach jest wysoce niepożądana.

Produkcja kwasy octowego:
• Maksymalne stężenie kwasu octowego produkowanego przy użyciu metod biologicznych
wynosi 10 – 15%
• W celu koserwacji gotowego produktu i obniżeniem kosztów transportu zatęża się poprzez
frakcjonowaną destylację ( do 20%) albo chemicznie usuwając wodę ( do 87%)
• Metodami biologicznymi uzyskuje się wyłącznie oet spożywczychOcet techniczny
wytwarza się metodami chemicznymi: z aldehydu octowego z acetylenu (w Polsce) lub
etanolu.

Inne zastosowania fermentacji octowej:
• Acetobacter sucoxydans: prowadzi niepełne utlanienia cukrów, alkoholi, kwasów, przy jego
zastosowaniu wytwarza się:
• L – sorbozę (do produkcji witaminy C) z D – sorbitolu (występuje w octowych, szczególnie
w jarzębinie);
• Dihydroksyacetony z glicerolu, wykorzystuje się także Acetobacter xylinum, Acetobacter
orleanense i Acetobacter aceti;
• Kwas winowy z glukozy w obecności soli wanadu.

Utlenianie D-sorbitolu i do L-sorbozy
Poprzez fermentację metodą powierzchniową albo wgłębną, uzyskuje się przy zastosowaniu
bakterii Gluconobacter oxydans utlenianie d-sorbitolu do l-sorbozy z wydajnością sięgającą
niekiedy 90%.
W procesie fermantacji, w podłoży na którym hodowana jest bakteria Gluconobacter oxydans,
oprócz sorbitolu (30%), znajduje się ekstrakt drożdżowy, wyciąg z kukurydzy oraz węglanu wapnia
w celu utrzymania pH na odpowiednim poziomie.
Reakcja ta ma charakter tzw. transformacji mikrobiologicznej, której efektem jest stosunkowo
drobna zmiana struktury sorbitolu, polegająca na odłączeniu od niego 2 atomów wodoru przy
drugim atomie węgla. Nie jest to jednak reakcja łatwa do osiągnięcia metodami chemicznymi, choć
ma doniosłe znaczenie.
Na skutek utlenienia (przez odwodorowanie) przy udziale Gluconobacter oxydans D-soritol zostaje
przekształcony w L- sorbozę. L-sorboza jest substratem do produkcji syntetycznej witami C, czyli
kwasu askorbinowego.
Witaminę tę można stosunkowo łatwo uzyskać z L-sorbozy przez odpowiednią przemianę
chemiczną. Mamy tu więc do czynienia z przykładem harmonijnego współdziałania mikrobiologii
przemysłowej z chemią, dzięki czemu stała się możliwa opłacalna produkcja przemysłowa
syntetycznej witaminy C.

Dihydroksyaceton z glicerolu
W przypadku produkcji dihydroksyacetonu (CH2OHCHCH2OH) substratem wyjściowym jest
glicerol. Jest to proces odwrotny niż w tzw. ferantacji glicerynowej (utleniania glicerolu do
dihydroksyacetonu). Tam dihydroksyaceton był tym zastępczym akceptorem wodoru, który
przyjmował wodór i ulegał redukcji do glicerolu w przypadku kiedy aldehyd octowy został
zablokowany dodaniem siarczynu. Tutaj mamy odwrotną sytuację. Gluconobacter oxydanas
utlenienia glicerol do dihydroksyacetonu.
Oprócz Gluconobacter oxydans proces ten mogą też prowadzić niektóre inne bakterie octowe jak
Acetobacter xylinum i Acetobacter aceti. Oprócz glicerolu (6%) potrzebny jest dodatek substancji
stymulujących rozwój bakterii, tj. wodę drożdżową. Fermantacja jest prowadzona w temp. 28-30 st.
C, pH 5,5 do 7.0. W tych warunkach uzyskuje się wysoką (95%) wydajność dihydroksyacetonu.

Otrzymywanie kwasu d-winowego
Kwas d-winowy uzyskuje się przez odfermentowanie glukozy przy użyciu Gluconobacter oxydans.
Najczęściej w warunkach fermantacji wgłębnej, a więc na skutek intensywnego nawietrzania r-ru
glukozy, przy czym proces ten zachodzi tylko w obecności specjalnych katalizatorów, których rolę
spełniają w tym przypadku sole wanadu. Jako produkt końcowy tej fermentacji otrzymuje się kwas
d-winowy (COOH – CHOH – CHOH – COOH) w postaci soli potasowej.

Fermentacja propionowa
Fermantacja propionowa – fermantaja wywołana przez bakterie propionowe (Propionibacterium
(P. freudenreichii subsp. freudenreichii, P. freudenreichii subsp. shermanii, P. acidipropionici,
P. jensenii, P. thoenii).
Charakterystyka bakterii propionowych
• należą do rodzaju Propionibacterium
• mają kształt pałeczek
• są gramdodatnie
• są względnymi beztlenowcami
• nie wytwarzają przetrwalników
• mają zastosowanie przy produkcji serów dojrzewających, np. sera edamskiego
(wytwarzający się kwas octowy i propionowy nadają serom charakterystyczny, nieco ostry
smak, a dwutlenek węgla powoduje powstawanie oczek w serze)
• bakterie te towarzyszą bakteriom mlekowym w zakwasach chlebowych, a niekiedy też w
kiszonkach.
Rownanie sumaryczne fermantacji propionowej
3CH3CHOHCOOH + bakterie propionowe => 2 CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2O + kcal
(kwas mlekowy + bakterie → kwas propionowy + kwas octowy + energia)

Chemizm fermentacji propionowej:


Występowanie
• Bakterie kwasu propionowego występują głównie w środowisku jelitowym (w żwaczu
i jelitach przeżuwaczy), a wtórnie w produktach mlecznych, zwłaszcza serach.
• Izoluje się je w warunkach beztlenowych z pożywki zaszczepionej serem szwajcarskim typu
ementaler i zawierającej mleczan oraz ekstrakt drożdżowy.
• W serze tym bakterie propionowe odgrywają istotną rolą w procesach dojrzewania
i wytwarzania smaku po koagulacji mleka we wczesnych etapach produkcji na skutek
dodania renniny (podpuszczki).

Substraty do fermantacji:
• Bakterie propionowe uzyskują energię w procesie fermentacji. Rozwijają się one
i wytwarzają kwas propionowy na podłożach zawierających glukozę, sacharozę, laktozę
i pentozę, a także kwas mlekowy, kwas jabłkowy, glicerynę i inne związki.
• W związku z tym jako substraty odpadowe mogą być wykorzystywane do tej fermentacji
m.in. serwatka, ługi posulfitowe lub hydrolizaty skrobiowe i celulozowe.

Synteza chemiczna
Kwas propionowy otrzymuje się na drodze etylenu, tlenku węgla i pary lub etanolu i tlenku węgla
przy zastosowaniu trójfluorku boru jako katalizatora. Inna metoda polega na utlenieniu aldehydu
propionowego lub alkoholu propylowego.

Usprawnienia fermentacji propionowej
W ostatnich latach wprowadzono jednak szereg istotnych usprawnień do fermentacji propionowej.
Dotyczyły one potanienia produkcji kwasu propionowego poprez zwiększenie jego wydajności,
zastosowanie tanich surowców, ulepszenie technologii fermentacji oraz zastosowanie nowych
metod odzyskiwania i oczyszczanie kwasu propionowego po fermentacji.
Oprócz fermentacji prowadzonej w sposób okresowy
• stosuje się również hodowlę półokresową (okresowa z ciągłym dodawaniem pożywki -
proces ze zmienną objętością czynną fermentora)
• oraz fermentację ciągłą w fermentorze przepływowym zasilanym pożywką (z fermentora,
w sposób ciągły, odprowadzany jest płyn pofermentacyjny z biomasą) i fermentację ciągłą
z recyrkulacją biomasy. W tym ostatnim wypadku mamy do czynienia z fermentacją
przebiegającą w fermentorze przepływowym, a odprowadzany z fermentora płyn
pofermentacyjny z biomasą przechodzi przez sprzężony z fermentorem separator, gdzie
komórki bakteryjne są zagęszczane za pomocą filtracji na różnego rodzaju membranach
półprzepuszczalnych i ponownie zawracane do fermentatora głównego.
• Wszystkie omówione procesy mogą wykorzystywać zarówno wolne jak i unieruchomione
komórki bakterii. W najnowszych rozwiązaniach, utworzony w czasie fermentacji kwas
propionowy jest usuwany i oczyszczany po zakończeniu fermentacji lub w czasie jej trwania
przy użyciu elektrodializy, destylacji, estryfikacji, nanofiltracji, wymieniaczy jonowych oraz
ekstrakcji w różnego typu rozpuszczalnikach.
• W systemach ciągłych z zawracaniem komórek bakteryjnych uzyskano produktywność
kwasu propionowego na poziomie 14,3 g/dm3 (l)/ godz., która była około 480 razy wyższa
niż w tradycyjnej fermentacji okresowej (0.03 g/dm3(l)/godz.).
• Przeprowadzono również udane próby otrzymania kwasy propionowego zarówno w skali
pilotowej jak i przemysłowej. W tym ostatnim przypadku zastosowano fermentor
o pojemności 37m3 oraz filtr ceramiczny do zagęszczenia bakterii o powierzchni 32m2.

Zastosowanie kwasu propionowego:
Do niedawna kwas propionowy służył niemal wyłącznie do otrzymywania związków zapachowych
dla przemysłu perfumeryjnego. Zapotrzebowanie na kwas propionowy wzrosło dopiero pod koniec
lat 60-tych, kiedy jego właściwości antyseptyczne, znane zresztą i wykorzystywane już wcześniej
do konserwowania produktów żywnościowych (zwłaszcza w piekarstwie i przemyśle owocowo –
warzywnym) zastosowano z dobrym skutkiem do ochrony pasz przez zniszczeniami
mikrobiologicznymi.
Z podobnym skutkiem może być kwas propionowy użyty do ochrony kiszonek oraz karmy
w postaci mieszanek treściwych, które po spryskaniu nim nadają się do żywienia zwierząt w ciągu
kilku dni od ich przygotowania, bez obawy zepsucia.
Kwas propionowy należy do produktów naturalnej fermentacji i nie oddziałuje toksycznie na
zwierzęta. Nie zmienia też smaku zakonserwowanych pasz, które w tej samej postaci chętnie
spożywane są zarówno przez przeżuwaczy, jak i zwierzęta jednożołądkowe., Poza rolnictwem kwas
propionowy i jego sole są wykorzystywane do produkcji herbicytów, rozpuszczalników estrowych,
celulozowych tworzyw sztucznych a propionian sodowy jest stosowany w leczeniu zwierząt.

22.03.2012
BAKTERIE FERMENTACJI MLEKOWEJ
Czystą kulturę bakterii mlekowych po raz pierwszy wyodrębnił Lister w roku 1880 i była to kultura Streptococcus lactis (obecnie Lactococcus lactis – paciorkowiec mleczny). Bakterie fermentacji mlekowej zaliczane są do rodzajów Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc i Pediococcus. Praktycznie jednak ta grupa bakterii często jest rozszerzana (nie bez kontrowersji) na bakterie z rodzajów: Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Sporolactobacillus, Streptococcus a nawet Listeria.
Charakterystyka:
- produkują kwas mlekowy z cukrów w procesie fermentacji,
- gramdodatnie,
- długie i krótkie laseczki i ziarniaki typu paciorkowcowego,
- metabolizm fermentacyjny,
- względnie lub bezwzględnie beztlenowe,
- optimum pH: 5,5-5,8
- mezo- lub termofilne.
• złożone wymagania pokarmowe w stosunku do aminokwasów, peptydów, zasad nukleinowych, witamin, minerałów, kwasów tłuszczowych i węglowodanów.
• najważniejsze rodzaje: Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus.
• (Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Sporolactobacillus, Streptococcus, Listeria.)
• brak wytwarzania przetrwalników – nie wytwarzają one przetrwalników ani żadnych innych form typu powiedzmy endospor, jeden wyjątek – jest nim Bacillus coagulans (dawniej B. dextrolacticus).
• brak ruchu - bakterie mlekowe są pozbawione możliwości samodzielnego poruszania się.
• brak zdolności do rozpuszczania żelatyny. W tym wypadku istnieje jeden wyjątek. Jest nim mianowicie Streptococcus faecalis subsp. liquefaciens.
• brak wytwarzania katalazy.
Charakteryzują się dość wysokimi wymaganiami odżywczymi, tzn. najlepiej rozwijają się na tzw. pożywkach naturalnych, takich jak mleko, serwatka, brzeczka niechmielona itd. Natomiast o wiele gorzej , a więc trudniej jest je hodować na pożywkach syntetycznych. W tym wypadku bardziej jeszcze wybredne są pałeczki mlekowe. Natomiast wśród ziarniaków mlekowych niektóre są bardziej tolerancyjne i mogą być hodowane na podłożach syntetycznych, względnie na podłożach syntetycznych uzupełnionych niektórymi tylko składnikami specjalnie przez te bakterie wymaganymi.
Ta wybiórcza często wrażliwość bakterii mlekowych, nieraz odnosząca się do poszczególnych aminokwasów czy poszczególnych witamin, wykorzystana została i jest dość szeroko stosowana obecnie w analityce. Posługujemy się do tego mutantami, które sztucznie są upośledzone do syntezy jakiegoś pojedynczego składnika i wtedy szczepy także mogą być wykorzystane do tzw. biologicznego oznaczania tych składników, tzn. witamin czy poszczególnych aminokwasów. Jak się okazuje, dokładność tych metod analitycznych nie ustępuje metodom chemicznym, czasem dokładność tych pierwszych jest większa, a przede wszystkim pod względem technicznym taka analiza jest wiele prostsza niż przeprowadzenie analizy chemicznej.
Podział systematyczny:
Istnieje szereg systemów. Duński bakteriolog, Orl-Jensen dzieli bakterie mlekowe na wie zasadnicze grupy:
I. Bakterie właściwej fermentacji mlekowej.
II. Bakterie psedofermentacji mlekowej.
W obrębie pierwszej grupy autor dzieli bakterie jeszcze na dwie podgrupy:
- bakterie homofermentacji mlekowej – trzy rodzaje: Lactococcus, Lactobacillus i Lactobacillus.
- bakterie heterofermentacji mlekowej – wyróżnia zasadniczo dwa rodzaje: Betacoccus (inaczej Leuconostoc) oraz Lactobacillus. Trzecim rodzajem zaliczanym tu jest Bifidobacterium, które wchodzą w skład mikroflory przewodu pokarmowego dzieci karmionych mlekiem matki.
Drugą grupę w podziale Orla-Jensena stanowią bakterie pseudofermentacji mlekowej. Tutaj występują dwa rodzaje:
- Tetracoccus zwany inaczej Micrococcus,
- Microbacterium.


Techniczne wykorzystanie:
• wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej do bezpośredniej biosyntezy określonych metabolitów, które są wytwarzane podczas ich rozwoju i wykorzystania ich do celów pośrednich w sensie przerobu lub utrwalenia niektórych produktów spożywczych.
• największa rola przypada tutaj produkcji kwasu mlekowego na drodze mikrobiologicznej. Stosowane są przede wszystkim pałeczki mlekowe ponieważ charakteryzują się one zdolnością wytwarzania większych ilości kwasu mlekowego – przynajmniej w granicach 1,5% a czasem nawet do 2% kwasu mlekowego.
Istnieją dwie metody produkcji kwasu mlekowego: synteza chemiczna i mikrobiologiczna (biosynteza), których roczna wydajność na świecie wynosi aktualnie 35 tys. ton.
 Synteza chemiczna polega na hydrolizie nitrylomleczanu (cyjanohydryny aldehydu octowego) tworzonego w wyniku reakcji aldehydu octowego z cyjanowodorem.
 Kwas mlekowy (kwas 2-hydroksypropanowy, dawniej też α-hydroksypropionowy) jest wytwarzany w trzech odmianach, tj. lewo D(-) i prawoskrętnej L(+) oraz optycznie nieczynnej (racemicznej DL), tj. zawierającej równe ilości kwasu prawoskrętnego i lewoskrętnego.
W zależności od surowca, który może być wykorzystany do mikrobiologicznej produkcji kwasu mlekowego stosuje się odpowiednie gatunki bakterii fermentacji mlekowej. Właściwie dzisiaj do tego celu najszerzej są wykorzystywane dwa zasadnicze surowce odpadowe, mianowicie serwatka, która stanowi produkt odpadowy przemysłu mleczarskiego, gdzie powstaje w dużych ilościach i właściwie dzisiaj ciągle jeszcze jest dość kłopotliwym produktem ubocznym i nie wiadomo co z nim zrobić. Dlatego bardzo pożądane jest wykorzystanie go do celów produkcyjnych jeśli chodzi o syntezę kwasu mlekowego.
Kwas mlekowy prawoskrętny jest przyswajalny przez organizm ludzki i zwierzęcy. Kwas mlekowy lewoskrętny nie jest szkodliwy dla organizmu, ale nie może być wykorzystany do celów energetycznych lub budowy komórek, jest on powoli wydalany.
Synteza chemiczna prowadzi do otrzymania racemicznego kwasu mlekowego, natomiast metodą biosyntezy otrzymuje się kwas zawierający więcej formy L(+). Tworzenie się kwasu D(-), L(+) lub DL zależy od stereospecyficzności pośredniczącego enzymu – dehydrogenazy mleczanowej oraz od obecności racemazy mleczanowej. Można też zastosować takie szczepy bakterii, które wytwarzają prawie wyłącznie kwas mlekowy prawoskrętny.
Kwas mlekowy łatwo tworzy podczas ogrzewania estry, w których jedna cząsteczka hydroksykwasu odgrywa rolę alkoholu, druga zaś – kwasu. W ten sposób tworzy się liniowy dimer – kwas laktylomlekowy i wyższe liniowe polimery. Podczas dalszego ogrzewania, odbywa się wewnątrzkomórkowa estryfikacja, w wyniku której powstają cykliczne laktydy. Te ostatnie stanowią punkt wyjścia dla syntezy biodegradowalnych polimerów kwasu mlekowego.
Drugim surowcem , który również ma charakter produktu odpadowego jest melasa.
W zależności od rodzaju substratu, a więc od tego, czy do produkcji użyta zostanie serwatka czy też melasa, dobierane są odpowiednie kultury bakterii.
Poza serwatką i melasą również polisacharydy, jak np. skrobia kukurydzy lub ziemniaków czy inulina topinamburu, po uprzedniej hydrolizie enzymatycznej lub chemicznej, mogą być wykorzystane w procesach fabrycznej biosyntezy kwasu mlekowego. Pałeczki mlekowe Lactobacillus brevis znane są z wysokiej efektywności fermentowania ksylozy i innych pentoz na kwas mlekowy i octowy. Także ługi posulfitowe, po ich zobojętnieniu i wzbogaceniu w niezbędne czynniki wzrostowe (np. przez dodanie kiełków słodowych) mogą być w opłacalny sposób fermentowane na kwas mlekowy przez paleczki L. plantarum.
Produkcja kwasu mlekowego w oparciu o serwatkę jako produkt odpadowy przemysłu mleczarskiego:
Podstawowym węglowodanem, który występuje w mleku, a zatem również i w serwatce, jest laktoza i dlatego też tutaj musi być użyta taka kultura bakterii mlekowej, która byłaby w stanie maksymalnie wykorzystać ten rodzaj źródła węgla, jakim jest laktoza. Okazało się, że najbardziej odpowiednie do tego celu kultury uzyskuje się w obrębie gatunków Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus lub L. helveticu, przy czym pierwszy z nich jest częściej wykorzystywany. Obydwa gatunki odfermentowują zarówno serwatkę naturalną jak i permeat serwatkowy (pozostałość po odbiałczeniu serwatki metodą ultrafiltracji).
Proces syntezy kwasu mlekowego w oparciu o wykorzystanie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, to ten proces, podobnie zresztą jak i inne tego typu procesy o charakterze mikrobiologicznym, rozpada się na kilka etapów, które w pierwszej kolejności prowadzą do uzyskania odpowiednio dużej ilości inokulum potrzebnego do wzbudzenia fermentacji mlekowej w kadzi produkcyjnej, gdzie następuje właściwy proces przemiany laktozy na kwas mlekowy.
W pierwszym etapie do namnożenia inokulum Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus stosujemy jałowy roztwór mleka odtłuszczonego w ilości około 1 litra. Inkubuje w optymalnej dla tego gatunku temperaturze 43°C w ciągu 24 godzin. Po tym czasie całą zawartość mleka z namnożoną kulturą bakterii przelewa się do wypasteryzowanego również odtłuszczonego mleka w ilości około 45 litrów w odpowiednim balonie szklanym i inkubuje w tych samych warunkach co poprzednio. Trzeci etap stanowi naczynie o większej pojemności (1900 l).
W tym przypadku podłożem na którym są namnażane bakterie jest spasteryzowana serwatka, czyli warunki jakie istnieją już w procesie produkcji przemysłowej. Jeśli chodzi o pozostałe parametry hodowli, to są one takie same jak poprzednio tzn. temperatura jest utrzymywana w tym samym zakresie tj. 43°C i okres namnażania trwa także jedną dobę. Na tym właściwie kończy się proces wyprowadzenia kultury zarodowej.
Następny etap to już jest proces właściwej produkcji przemysłowej, która jest prowadzona najczęściej w kadziach wykonanych z nierdzewnej stali kwasoodpornej.
Pojemność kadzi fermentacyjnej wynosi około 20 m3 i zawiera ona również serwatkę spasteryzowanej, do której wlewa się całą objętość przygotowanego wcześniej inokulum bakterii Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Temperatura jest utrzymywana na tym samym poziomie 43°C, natomiast okres fermentacji jest tutaj dłuższy, tj. 42-45 godz., w trakcie fermentacji głównej prowadzi się okresowe zobojętnianie wytwarzającego się kwasu mlekowego. Po upływie każdych kolejnych 6 godzin wprowadza się do fermentującego podłoża porcję wodorotlenku wapnia (wapna gaszonego) , który wiąże wytwarzający się kwas mlekowy i przemienia go na mleczan wapnia, przy czym ilość tego środka neutralizującego dodawana jest w taki sposób, aby stężenie wolnego kwasu mlekowego nie przekraczało 0,6%, ponieważ bakterie mlekowe wytwarzają kwas mlekowy i posiadają pewną naturalną tolerancję na jego działanie.
Po osiągnięciu maksymalnej granicy wytrzymałości, tzn. około 2%, w ogóle dalszy proces przemiany laktozy na kwas mlekowy ulega całkowitemu zahamowaniu. Aby temu zapobiec wprowadza się środki neutralizujące i w ten sposób proces ukwaszania może być przedłużony i cała ilość zawartych węglowodanów, a więc zawartej laktozy, może być w ten sposób przemieniona na kwas mlekowy, a ten z kolei na mleczan wapnia poprzez wprowadzenie środków neutralizujących.
Uzyskany w ten sposób roztwór mleczanu wapnia, lekko jeszcze podkwaszony, podlega oczyszczeniu poprzez wprowadzenie partii ziemi okrzemkowej i węgla aktywnego.
Wyklarowany roztwór mleczanu wapnia kierowany do dalszych operacji technologicznych, tzn. do pozgęszczania, krystalizacji i przemywania.
Proces zagęszczenia mleczanu wapnia przeprowadzany jest w urządzeniach zwanych wyparkami, przy czym proces ten jest prowadzony w warunkach obniżonego ciśnienia, tzn. prowadzi się go przy podciśnieniu 625 mm Hg. Chodzi o to, żeby pozbyć się pewnej ilości wody, ale aby uczynić to w taki sposób, żeby nie spowodować rozkładu mleczanu wapnia, a więc działać temperaturą niezbyt wysoką.
Asortyment kwasu mlekowego, który się uzyskuje w procesie jego mikrobiologicznej produkcji:
- kwas mlekowy techniczny,
- kwas mlekowy spożywczy,
- kwas mlekowy czysty.
Kwas mlekowy techniczny jest najmniej oczyszczony. Nie prowadzi się jego krystalizacji. Uzyskuje się go z roztworu mleczanu wapnia, po jego odbiałczeniu i po traktowaniu węglem aktywnym i ziemią okrzemkową. W ten sposób wstępnie oczyszczony roztwór mleczanu wapnia pozgęszcza się do 13,5° Be, rozszczepia traktując odpowiednią porcją kwasu siarkowego i po oddzieleniu gipsu w tych warunkach uzyskuje się roztwór kwasu mlekowego o stężeniu około 22%, z tym, że może być on oczywiście podgęszczony nawet w granicach 44-50%. W każdym razie ma on postać ciemnego płynu, który jest pakowany w beczkach drewnianych i w ten sposób rozprowadzany.
W przypadku kwasu mlekowego spożywczego jego stopień czystości jest wyższy. Uzyskiwany jest on już z przemytych kryształów mleczanu wapnia po pierwszej jego krystalizacji, następnie rozszczepiany jest kwasem siarkowym i uzyskuje się w rezultacie tego kwas mlekowy, który jest przezroczysty jak woda o koncentracji od 44-50% i w handlu w takiej formie jest on wprowadzany po rozlaniu do butelek.
Jeśli chodzi i kwas mlekowy czysty, to ten jest oczyszczony w najwyższym stopniu i przeznaczony dla potrzeb przemysłu chemicznego (tam, gdzie sprawa czystości odgrywa często bardzo istotna rolę). Koncentracja tego kwasu wynosi zazwyczaj około 65%. Tak wygląda proces produkcji kwasu mlekowego w oparciu o wykorzystanie serwatki.
Jeśli chodzi o produkcję kwasu mlekowego na melasie, to tutaj przede wszystkim rzecz jasna konieczne jest użycie innego szczepu bakterii. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus byłby w tym stanie rzeczy nieprzydatny, ponieważ on ma ograniczoną możliwość korzystania z węglowodanów typu sacharozy, która występuje w melasie. Dlatego też w przypadku produkcji kwasu mlekowego przy wykorzystaniu melasy jako surowca wyjściowego jako kultury produkcyjnej używa się Lactobacillus rhamnosus (dawniej L. delbrueckii). Jest to pałeczka mlekowa, dość dużych rozmiarów, która charakteryzuje się wysoką aktywnością w zakresie fermentacji glukozy lub sacharozy na kwas mlekowy.
Wszystkie omówione procesy mogą wykorzystywać zarówno wolne, jak i unieruchomione komórki bakterii. Do immobilizacji wykorzystuje się:
• metodę pułapkowania komórek w żelach (agarowym, alginianowym, poliakrylamidowym lub żelach z alkoholu poliwinylowego);
• adsorpcję w postaci błony na nośnikach stałych (materiały ceramiczne, szkło porowate, wióry polipropylenowe, pianka poliuretanowa itp.);
• stworzenie takich warunków hodowli, w których bakterie występują w formie agregatów stanowiących rodzaj ich naturalnej immobilizacji.
W najnowszych rozwiązaniach, utworzony w czasie fermentacji kwas mlekowy może być usuwany i oczyszczany po zakończeniu fermentacji lub w czasie jej trwania przy użyciu dializy lub elektrodializy, odwróconej osmozy, destylacji, mikro- i ultrafiltracji, wymieniaczy jonowych i adsorpcji oraz ekstrakcji w różnego typu rozpuszczalnikach.
Ogólna ilość produkowanego kwasu mlekowego na świecie szacowana jest na ok. 50 tys. ton rocznie i szybko wzrasta. Z ogólnej ilości wytworzonego kwasu mlekowego 30-50% przypada na kwas racemiczny, pochodzący z syntezy chemicznej. W Polsce jedynym producentem kwasu mlekowego spożywczego jest Przedsiębiorstwo Przemysłu Fermentacyjnego „Akwawit” w Lesznie. Przy aktualnym poziomie produkcji ok. 2000 ton 50% kwasu rocznie, jego niedobór ocenia się na około 2 tys. ton.
Kwas mlekowy w Lesznie jest wytwarzany z cukru białego przy użyciu szczepów bakterii Lactobacillus rhamnosus, które po zakończeniu fermentacji mogą być wykorzystane do zaszczepienia masy roślinnej przeznaczonej na kiszonkę.
Kwas mlekowy ma duże zastosowanie w przemyśle chemicznym i spożywczym. Jest używany w garbarstwie do odwapniania skór, w przemyśle włókienniczym służy jako zaprawa przy barwieniu tkanin niektórymi barwnikami. Czysty, bezbarwny kwas mlekowy jest używany przy wyrobie niektórych mas plastycznych, zaś jego polimer daje biodegradowalne tworzywo wykorzystywane w formie opakowań przez przemysł spożywczy. Mleczan żelazawy stosuje się w przemyśle farmaceutycznym, mleczan sodowy jest używany w medycynie jako lek, zaś mleczan miedziowy ma poważne znaczenie w nowoczesnych metodach galwanoplastyki.
Mleczan wapnia z kolei jest wykorzystywany do produkcji syropów leczniczych i wielu leków oraz może być składnikiem proszków do pieczenia i pewnych rodzajów wyrobów cukierniczych.
W tej formie służy on jako źródło łatwo przyswajalnego dla organizm wapnia.
Dodatek kwasu mlekowego jest korzystny w produkcji chleba typu „Graham” i niektórych innych rodzajów pieczywa pszennego. W skład preparatów polepszających jakość pieczywa wchodzi często tzw. stały kwas mlekowy, który jest mieszaniną kwasu mlekowego i mleczanu wapnia.
Kwas mlekowy w przeciwieństwie do kwasu octowego jest w pełni przyswajalny przez organizm. Nie jest szkodliwy dla organizmu ludzkiego i jak stwierdzono jest on nawet glikogenotwórczy. W przemysle spożywczym może zastępować w produkcji lemoniad kwas cytrynowy i winowy. W gospodarstwie domowym zastępuje ocet przy sporządzaniu posiłków dietetycznych i jak wykazano jest od niego o wiele zdrowszy.
Każdy dietetyk wie, iż przy schorzeniach wątroby, nerek, woreczka żółciowego i trzustki istnieją surowe zakazy spożywania produktów spożywczych z dodatkiem octu. Wykazano również, że zastępowanie octu kwasem mlekowym znacznie zmniejsza zagrożenia chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak przewlekły nieżyt żołądka, nadkwasowość żołądka, przewlekłe zapalenie okrężnicy oraz inne.
Wydaje się więc, że przemysł przetwórstwa owocowo-warzywnego, chcąc produkować zdrową żywność, powinien stopniowo eliminować w zalewach kwas octowy na korzyść kwasu mlekowgo lub przynajmniej stosować mieszankę obydwu kwasów.

Czynniki ograniczające infekcje w procesach mikrobiologicznych:
 duże stężenie substratu czynnego osmotycznie (drożdże osmofilne);
 duża ilość inokulum (produkcja etanolu z melasy, ok 50%);
 wysoka lub niska temperatura procesu (termo- lub psychrofilne);
 niska wartość pH podłoża (fermentacja cytrynowa, octowa);
 powstanie produktów ograniczających rozwój patogenów (etanol, aceton, kwas mlekowy, nadtlenek wodoru itp.).

2012-06-20
MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA
WYKŁAD 1:
Mikrobiologia przemysłowa- zastosowanie wiedzy mikrobiologicznej i inżynierii w procesach przemysłowych z zastosowaniem mikroorganizmów lub komórek roślin i związków do produkcji dóbr konsumpcyjnych. Wykorzystuje określone gatunki mikroorganizmów w branżach przemysłowych.

Działy mikrobiologii:
1) w przemyśle spożywczym – produkcja żywności w oparciu o prowadzone przez mikroorganizmy fermentacje tlenowe i beztlenowe
2) przemysł farmaceutyczny – produkcja antybiotyków, leków steroidowych, witamin, probiotyków, szczepionek, hormonów.
3) Przemysł chemiczny- produkcja aminokwasów, rozpuszczalników (butanol, aceton), dekstranów, kwasu glikuronowego, bioetanolu.

Diagnostyka mikrobiologiczna:
- produkcja odczynników, testów diagnostycznych i aparatur do diagnostyki mikrobiol.
- opracowanie zasad kontroli czystości mikrobiologicznej dla pracowni technicznych.

Ochrona środowiska:
- uzyskiwanie pierwiastków z użyciem technik „przyjaznych” dla środowiska naturalnego
- ługowanie metali
- zatężanie czegoś z wód kopalnianych lub wody morskiej
- bioremediacja gleb skażonych produkcjami ropopochodnymi
- stosowanie „Stopnia biologicznego” w oczyszczalniach ścieków” powiązanego z produkcją biogazu

Produkcja preparatów enzymatycznych:
- izolacja enzymu z hodowli naturalnych prod.
- produkcja enzymu z wykorzystaniem mikroorganizmów rekombinowanych

Uzyskiwanie odpowiedniego szczepu produkcji. Szczep powinien charakteryzować się:
- być czystą kulturą wolną od fagów
- niepatogenne
- wytwarzać cenne produkty, bez uzdolnień do syntezy toksycznych metabolitów
- czas biosyntezy produktu powinien być krótki
- stabilność biologiczna, zdolna do długotrwałego przechowywania
- wytwarzanie komórek wegetatywnych i spor
- minimalne ryzyko zakażenia

Źródła szczepów:
- środowisko naturalne
- środowisko przekształcone przez człowieka
- kolekcje szczepów
- inne źródła

Produkcja żywności
Warunki hodowli Drobnoustrój
4-15*C
42-100*C
Ph 2-4
Stęż NaCl (5-20%)
Obecność antrozyny
Dodatek metali ciężkich
Obecność gazu obojętnego Psychrofile
Termofile
Acidofile
Halofile
Promieniowce
d. akumulujące metale ciężkie
beztlenowce


Kolekcja szczepów :
- zapewnienie referencyjnych szczepów bakteryjnych do celów badawczych, porównawczych, edukacyjnych. Zadania:
*poszukiwanie nowych szczepów oraz ulepszanie z wykorzystaniem inżynierii genetycznej
* klasyfikacja drobnoustrojów
* dobór metod przechowywania drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych

Sposoby zwiększania czułości aktywności metabolicznej:
- zmniejszenie grubości warstwy podłożą testowego
- zmniejszenie stężenia substratu lub czynnika chromogennego
- zmiana wartości ph, temperatury reakcji itp.

Cele doskonalenia szczepu produkcyjnego:
- wzrost wydajności produktu. :
* zwiększenie kopii genów
* przerwanie regulacji genów
*zmiana przepuszczalności błony komórkowej w celu zwiększenia wydzielania produktu
- poprawa bioprocesu
*skrócenie czasu fermentacji
* zdolność do wykorzystania tanich substratów
* brak zdolności do biosyntezy niekorzystnych produktów
* zmniejszone zapotrzebowanie na tlen
* zmniejszone tworzenie piany
*tolerancja na wysokie stężenie C i N2
*oporność na fagi
- nowe produkty- zmiany w genotypie mikroorganizmów prowadzących do biosyntezy nowych metabolitów

Adaptacja – indukcja biosyntezy zakodowanych w genomie drobnoustrojów enzymów lub mutacji prowadzącej do zmiany enzymów normalnie produkowanych i mechanizmów ich kontroli


Przyczyny adaptacji:
- indukcja specyficznych enzymów w populacji drobnoustrojów prowadzącej do zwiększenia zdolności degradacyjnych określonych ksenobiotyków
- zwiększenie specyficznej subpopulacji drobnoustrojów zdolnych do metabolizowania ksenobiotyku
- selekcja mutantów z nabytą zmienioną specyficznością lub nową aktywnością metaboliczną która wcześniej nie była obecna w danej populacji mikroorganizmów





WYKŁAD 2 (23.02.2012 r.)
MUTAGENEZA In vitro:
• Mutacje spontaniczne
• Promieniowanie: UV, X, ᵧ
• Czynniki chemiczne: kwas azotowy (III), hydroxylamina (NH2OH), związki alkilujące, analogi zasad azotowych, barwniki akrydynowe
• Insercja transposonowa
SKUTECZNE DOSKONALENIE KULTUR:
 W zrównoważonym programie doskolenia kultur użyte metody powinny się wzajemnie uzupełniać
 W przeszłości, sukcesy w tym kierunku były głównie oparte na wykorzystaniu technik wielostopniowej mutagenezy i selekcji
 Wydajność penicyliny wynosi 85, 000 unitis/ml (ok. 50 g/l), tj. 850-krotnie więcej w porównaniu ze szczepem P. chrysogenum wyizolowanym przez Fleminga
selekcja udoskonalonych mutantów-1
SKRYNING LOSOWY:
 Najlepsze szczepy są poddawane wielostopniowej mutagenezie i selekcji
 Liczba testowanych mutantów jest zwykle ograniczona do 1000 do 2000 tygodniowo
 Skryning jest pracochłonny wymagający testowania w II etapie 10-30% wybranych kultur w próbach fermentacyjnych
PRZYKŁADY PROGRAMÓW MUTACYJNO- SELEKCYJNYCH
• Wyselekcjonowano homoserynowe auksotrofy Corynobacterium glutamicum, które syntetyzują lizynę z 200-300 razy większą wydajnością niż szczep rozdzielczości
• Doskonalenie szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarzał pierwszy w dziejach lecznictwa antybiotyk z wydajnością zaledwie 100 jednostek na 1 ml pożywki. Po latach intensywnej, wieloetapowej mutagenezy osiągnięto szczepy produkcyjne wytwarzające penicylinę w stężeniach ponad 85 000 jednostek na ml
SELEKCJA MUTANTÓW REGULACYJNYCH
Technika selekcji mutantów opornych w stosunku do toksycznych analogów metabolitów pośrednich ma na celu ułatwienie wyizolowania mutantów regulatorowych, u których zakłócony lub wyeliminowany został system kontroli metabolicznej na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Cel ten może być osiągnięty przez prowadzenie skriningu mutantów w obecności toksycznych analogów, np. aminokwasów czy nukleotydów (pełniących rolę tych inhibitorów). Nabycie trwałej oporności w stosunku do tych analogów może stać się genetyczną przyczyną nadprodukcji określonych metabolitów pierwszorzędowych, np. aminokwasów ponieważ zniesienie systemu regulacji pociąga za sobą podwyższenie ilości lub katalitycznej aktywności odpowiednich enzymów.
 Tą drogą uzyskiwano cenne mutanty regulatorowe, syntetyzujące zwiększone ilości aminokwasów
 Mutanty Corynobacterium oporne na metioninę charakteryzowały się 18-krotnie wyższą produkcyjnością metioniny
 Szczepy wytwarzające tryptofan selekcjonuje się w oparciu o ich oporność na jego toksyczny analog metylotryptofan. Po selekcji w kierunku oporności na 5-metylotryptofan uzyskane także u kukurydzy [zea mays] 200-krotnie zwiększoną zawartość tryptofanu.
Selekcja udoskonalonych mutantów-2
o Sekcja bezpośrednia polegająca na określeniu produktywności szczepów [np. hodowle w warunkach chemostatu w warunkach ograniczających wydzielanie produktu]
Selekcja udoskonalonych mutantów-3
Pośrednie metody racjonalnego skryningu polegają na:
 Detekcji i (lub) rewersji auksotrofii
 Poszukiwaniu mutantów konstytutywnych
 Obniżeniu stopnia inhibicji produktem końcowym
 Obniżeniu poziomu katabolicznej represji
 Zwiększeniu oporności w stosunku do toksyczności analogów produktów pośrednich metabolizmu
 Obniżeniu wrażliwości w stosunku do wybranych składników pożywek lub prekursorów
 Selekcji mutantów o zwiększonej przepuszczalności ściany komórkowej
SELEKCJA MUTANTÓW REGULACYJNYCH
 Ponadto selekcjonuje się liczne szczepy grzybów nitkowatych i drożdży w kierunku ograniczenia wpływu represji katabolicznej. Jedną z najczęściej stosowanych metod selekcji tego typu mutantów jest hodowla populacji na podłożach zawierających łatwo przyswajalne źródło węgla w dużych stężeniach oraz substrat dla danego enzymu ( glukozę) względnie jej toksyczny analog-2-deoksy-D-glukozę.
Metody doskonalenia drobnoustrojów przemysłowych- 3
REKOMBINACJA:
1. Rekombination u grzybów: cykle seksualny i paraseksualny
2. Rekombinacja u bakterii: transformacja, transdukcja i koniugacja
3. Przegrupowanie czynników genetycznych przy użyciu transposonów
4. In vitro fuzja protoplastów
5. Techniki rekombinacji DNA In vitro
STRATEGIE DLA WYKORZYSTANIA INŻYNIERII GENETYCZNEJ
• Źródło DNA
• Wektory
• Gospodarze
• Inżynieria mataboliczna
• Biologia syntetyczna

ŹRÓDŁO DNA DLA BAKTERII
1. Chromosomalny DNA otrzymany w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi
2. Komplementarny DNA (cDNA) z dodatkiem linkerów
3. Syntetyczny DNA
WEKTORY używane w inżynierii genetycznej bakterii oraz ich teoretyczne pojemności:
• Plazmid >20 kb
• Bakteriofag (lambda) do 22 kb
• Bakteriofag P1 95 kb
• Kosmity 35-43 kb
• BAC 300 kb
(sztuczny chromosom bakteryjny)
BAKTERIE JAKO GOSPODARZE DLA EKSPRESJI INFORMACJI GENETYCZNEJ:
o Bakterie G (-) są zdolne do ekspresji genów bakterii G (+), jednakże w sytuacji odwrotnej nie zawsze jest to osiągalne
o Niestabilność niektórych heterologicznych białek w komórkach gospodarza (proteazy)
o Problemy z sekrecją: białka inkluzyjne
o Niewłaściwe fałdowanie polipeptydu, co jest przyczyną powstawania nieaktywnych białek gromadzących się wewnątrz komórek w formie ciałek
o Trudności w procesie post- translacyjnej modyfikacji białek, t.j. glikozylacja, fosforylacja czy amidacja
DROBNOUSTROJE EUKARIOTYCZNE JAKO GOSPODARZE DLA EKSPRESJI INFORMACJI GENETYCZNEJ
• Saccharomyces cerevisiae [ bezpieczny, duża ilość informacji, łatwy i tani w hodowli w skali przemysłowej, stosunkowo szybki wzrost oraz łatwy do genetycznej manipulacji/ wydajność produktu stosunkowo nieska (1-5% całkowitej ilości białek)
• Metylotroficzne drożdże Pichia pasteris i Hansenula polymorpha (posiadają silne indukcyjne parametry, oraz post-translacyjną modyfikację podobną do występującej w komórkach ludzkich, jednakże nie wydzielają wielu własnych białek do podłoża)

ZASTOSOWANIE METOD INŻYNIERII GENETYCZNEJ
o Inżynieria genetyczna stwarza perspektywy uzyskiwania drobnoustrojów produkujących o zupełnie nowych właściwościach. W procesach mutagenezy i rekombinacji genetycznej zakres możliwych modyfikacji jest ograniczony zasobem informacji genetycznej zawartej w genomie jednego organizmu, lub dwóch należących do tego samego gatunku.
o Inżynieria genetyczna umożliwia łączenie fragmentów genomów pochodzących z dowolnych organizmow dzięki enzymom restrykcyjnym wykazującym szczególną właściwość rozpoznawania określonych sekwencji nukleotydów w łańcuchu DNA i przecinaniu cząsteczki kwasu nukleinowego w idealny sposób, niezależnie od źródła pochodzenia DNA.
o Metody inżynierii genetycznej weszły do praktyki przemysłowej w przemyśle farmaceutycznym. Zrekombinowane mikroorganizmy produkują ludzką insulinę (wprowadzona na rynek europejski i USA w 1982 r.) i ludzki hormon wzrostu (wprowadzony na rynek amerykański w 1985 r.). Ważnym osiągnięciem polskiej biotechnologii jest opracowanie i wdrożenie technologii produkcji insuliny ludzkiej Gensulin (w 2000 r.), która jest pierwszym całkowicie polskim lekiem wytwarzanym przez rekombinowane drożdże. Jest to jeden z kilku zarejestrowanych na świecie preparatów ludzkiej insuliny.
o Opracowano i stosuje się w procesach produkcyjnych zrekombinowane mikroorganizmy do wytwarzania wielu innych leków, które przechodzą mniej lub bardziej zaawansowane próby kliniczne, takich jak: ludzki interferon α, β i ᵧ, aktywatory plazminogenu, czynniki białkowe krwi stosowane w leczeniu hemofilii, nowotworowy czynnik nekrotyczny (TNF), inhibitor interleukiny 1, limfokiny, prostoglandyny i ich pochodne, szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby, pryszczycy, zestawy diagnostyczne w endokrynologii, nowe środki antykoncepcyjne, genetyczne sondy diagnostyczne do identyfikacji wielu chorób dziedzicznych i zakaźnych itd. Ich droga na rynek, tzn. do pacjenta, przedłuża się ze względu na konieczność przeprowadzenia długotrwałych badań kontrolnych.
CECHY ISTOTNE Z PUNKTU WIDZENIA INŻYNIERII BIOPROCESOWEJ
W komórkach Saccharomyces sp. Udało się sklonować i uzyskać aktywną ekspresję genów typu ”killer”, kodujących białka odpowiedzialne za toksyczność w stosunku do innych grup mikroorganizmów
Wyizolowanie hipertermofilnej β-glukozydazy z bakterii Sulfolobus sulfataricus bytującej w kraterze wulkanu oraz termo stabilnych proteinaz z Pyrococcus i Thermococcus umożliwiło sklonowanie genu tego ostatniego gatunku bakterii w B. subtilis, co pozwoliło na syntezę białka enzymatycznego aktywnego w temp. 110°C
Delecja sekwencji inercyjnych (IS) z genomu E.coli pozwoliła na uzyskanie szczepu o zwiększonej stabilności.
GENETYCZNE PROBLEMY Z UŻYCIEM DROBNOUSTROJÓW ZAWIERAJĄCYCH rDNA
Niestabilność:
 Strukturalna zrekombinowanego DNA
 Segregacyjna plazmidu- wektora
 Przechowywanie klonów
 Warunki hodowli

CZYNNIKI WARUNKUJĄCE WYDAJNOŚĆ EKSPRESJI SKLONOWANEJ INFORMACJI GENETYCZNEJ
 Struktura wektora i liczba jego kopii
 Indywidualna charakterystyka promotora
 Stabilność mRNA
 Rodzaj lidera i mikroorganizmu
 Regulacja transkrypcji i translacji
 Integracja i rekombinacja z genomem gospodarza
 Replikacja autonomiczna
INŻYNIERIA METABOLICZNA- 1
Interdyscyplinarna dziedzina wykorzystująca zasady inżynierii reakcji chemicznych, technik obliczeń numerycznych, biochemii i biologii molekularnej dla zmiany szlaków metabolicznych. Inżynieria metaboliczna posługuje się racjonalną, tzn. wykorzystującą ilościowe, matematyczne metody opisu przemian wewnątrzkomórkowych, analizą efektów zmian genetycznych.
Obejmuje ona trzy zasadnicze etapy:
1. Syntezę tzn. tworzenie zrekombinowanych komórek o zminionych właściwościach
2. Analize właściwości uzyskanych komórek
3. Projektowanie dalszych zmian genetycznych
INŻYNIERIA METABOLICZNA- 2
Główne obszary zastosowań inżynierii metabolicznej to:
1. Polepszenie wydajności i produkcyjności natywnych produktów biosyntezy
2. Rozszerzenie zakresu substratów asymilowanych przez drobnoustroje
3. Wytwarzanie produktów nowych dla komórki dla komórki ( białka , biopolimery)
4. Poprawienie ogólnych cech komórki (np. dostosowanie do warunkow hodowli, zmiana szlaków asymilacji azotu, zapobieganie nadprodukcji niepożądanych substancji)
5. Wytwarzanie związków chiralnych jako produktów pośrednich dla farmacji
6. Zastosowanie medyczne: analiza metabolizmu całych organów i tkanek, identyfikacja mechanizmów rozwoju chorób i ich kontroli, sprawdzanie efektywności terapii.
MODYFIKACJE SZLAKU METABOLICZNEGO
• Regulacja potencjału erdoks u drożdży S.cerevisiae przez ekspresję genu kodującego dehydrogenazę 3-fosfoglicerynową zależną od NADH z Lactococcus lactis, w wyniku czego obniżony został poziom wewnątrzkomórkowego NADH (5-krotnie) oraz stosunek NADH/NAD (6-krotnie). Skutkiem tego była redystrybucja przepływu metabolitów, oraz zmniejszona produkcja etanolu, glicerolu i bursztynianu, natomiast stwierdzono nadprodukcję octanu, aldehydu oraz acetony
• Nadprodukcja oksydazy NADH oraz dekarboksylazy pirogronianowej prowadzi do powstania aldehydu octowego jako głównego produktu końcowego zamiast kwasu mlekowego.
BIOLOGIA SYNTETYCZNA
W 1974r. polski genetyk Wacław Szybalski wprowadził do użycia termin biologia syntetyczna pisząc; pozwólcie,że skomentuje pytanie „co dalej”. Aż do teraz pracowaliśmy nad opisową fazą biologii molekularnej. … jednakże prawdziwym wyzwaniem jest wkroczenie do fazy badań obejmujących biologię syntetyczną. Będziemy wymyślać nowe elementy kontrolne i wprowadzać je do genomów lub tworzyć od podstaw nowe genomy. Będzie to pole do popisu o niczym nie ograniczonym potencjale badawczym i praktycznie brak żadnych ograniczeń względem tworzenia „nowych, lepszych układów regulacyjnych” i w końcu… całych „syntetycznych” organizmów, na podobieństwo „nowych, lepszych myszy”… nie mam obaw co do tego, że da to początek ekscytującym, nowatorskim ideom,… w dziedzinie całej biologii syntetycznej.
BIOLOGIA SYNTETYCZNA- jest nową metodą, integrująca nauki biologiczne, inżynieryjne i matematyczne. Dzięki temu istnieje możliwość lepszego zrozumienia mechanizmów sterujących biologicznymi procesami. Opiera się ona na konstruowaniu lub przebudowywaniu składników, w kombinacje i systemy, które nie występują naturalnie. Wykorzystuje ona elementy inżynierii, nanotechnologii i biologii molekularnej.
POTENCJALNE ZASTOSOWANIA:
 Biologia syntetyczna pozwala na lepsze poznanie molekularnych mechanizmów kierujących procesami regulacyjnymi w komórkach. Ma to potencjalne znaczenie w medycynie i wielu procesach biochemicznych w przemyśle, przez konstrukcje mikroorganizmów, które mogłyby wytwarzać nowe farmaceutyki, degradować substancje toksyczne, niszczyć komórki rakowe, produkować wodór dla „ samochodów przyszłości” czy też naprawiać uszkodzone geny;
 Inni widzą w biologii syntetycznej podstawę do stworzenia komputerowego systemu, która pozwoli na ominięcie prób klinicznych, będących nieodłącznym etapem podczas opracowania technologii wprowadzania nowych leków
 Ostatnim osiągnięciem naukowców było zsyntetyzowanie pętli pamięci DNA, co było znaczącym krokiem w stronę rozwoju biologii syntetycznej.
PODSUMOWANIE:
 Doskonalenie drobnoustrojów przemysłowych jest podstawą do komercjalizacji określonych produktów tj. enzymy, aminokwasy, antybiotyki i inne.
 Istotny wpływ na efektywność stosowanych metod ma znajomość szlaków metabolicznych dla doskonalonych produktów
 Dobór drobnoustrojów do określonego procesu powinien uwzględnić skład podłoża oraz warunki hodowli
 Dla uzyskania wyższych wydajności bioproduktów przy wykorzystaniu inżynierii metabolicznej niezbędna jest skoordynowana ekspresja (lub/i) inhibicja kilku genów
 Wkraczamy w okres racjonalnego projektowania nowych systemów oraz intensywnego wykorzystania technik modelowania matematycznego w celu przewidzenia zachowania się układu oraz optymalizacji jego działania.



1.03.2012r – WYKŁAD 3

TECHNICZNE WYKORZYSTANIE MIKROORGANIZMÓW
Wstępne różnicowanie aktywności metabolicznych mikroorganizmów
• Dobór aktywnych szczepów do celów technologicznych można prowadzić stosując testy skriningowe już podczas izolacji kolonii lub testując wyizolowane wcześniej kultury.
• Możliwość pewnego usprawnienia tych badań stwarza zastosowanie odpowiednich substratów lub wskaźników na podłożu testowym , powodujących pojawienie się wokół kolonii barwnych stref wskazujących na występowanie określonej aktywności metabolicznej określonych monokultur. Skrobia, kazeina, celuloza – jaśniejsze strefy wokół kolonii.
• W przypadku amylaz płytki można również zalać roztworem jodu w wyniku czego powstają strefy niewybarwione na kolor granatowy świadczące o rozłożeniu skrobi, natomiast traktowanie płytki z żelatyną kwasem sulfosalicylowym pozwala zwiększyć kontrast jasnych stref na opalizującym tle tworzonych przez aktywne proteolitycznie kultury.
• Duże usprawnienie selekcji kultur aktywnych w zakresie określanych biosyntez umożliwia zastosowanie chemicznie modyfikowanych barwnych substratów, takich jak: starch-azure, blue-dextran, blue-celulose.
• Wprowadzenie do podłoża selektywnego określonych wskaźników pozwala na szybkie różnicowanie kolonii mikroorganizmów wytwarzających lub przekształcających wiele związków chemicznych. Identyfikację kultur wytwarzających kwasy organiczne lub aminy umożliwia zastosowanie w testach z użyciem pożywek agarowych na płytkach Petriego błękitu bromofenolowego lub czerwieni obojętnej, które zmieniają barwę w zależności od pH.
• Doboru kultur aktywnych w zakresie wytwarzanych aminokwasów dokonuje się w oparciu o metody selekcji mutantów regulatorowych o zniesionych lub zmienionych mechanizmach represji. W tym celu używa się tzw. metody płytek gradientowych polegającej na przygotowaniu płytek zawierających podłoże o stopniowo malejącym stężeniu związków toksycznych, które są analogami metabolitów lub prekursorów produktów końcowych. Cenne kultury przemysłowe selekcjonuje się spośród wyrosłych kolonii w strefie dużej koncentracji toksycznego związku. Metoda ta w formie zmodyfikowanej jest również przydatna do selekcji ……
• Identyfikację drobnoustrojów wytwarzających aminokwasy i witaminy można również przeprowadzić stosując metodę auksonografii, w której testowane kolonie będące mutantami auksotroficznymi wysiane do podłoża minimalnego zalewa się warstwą drugiego z odpowiednio dobranym organizmem testowym.
• Strefy ich wzrostu wokół badanych kolonii świadczą o wytwarzaniu danego metabolitu przez komórki drobnoustrojów.
• Według podobnej zasady selekcjonuje się szczepy wytwarzające antybiotyki. W tym celu po okresie inkubacji obserwuje się wielkość stref (proporcjonalnych do ilości wydzielanego antybiotyku) zahamowania wzrostu szczepu testowego, powstającej pod wpływem antybiotyku wydzielanego przez mutanta.
• Wykrycie syntezy nukleaz (DNazy, RNazy) umożliwia stosowanie testów z kwasem solnym, który powoduje zmętnienie w miejscach zawierających niezhydrolizowany kwas nukleinowy. Podobną funkcję pełni również test z oranżem akrydyny umożliwiającym obserwację w UV fluorescencji w miejscach z nierozłożonym polimerem.
• W celu wykrycia obecności inhibitorów enzymów często stosuje się substraty zmieniające w wyniku reakcji barwę lub odczyn środowiska. Do identyfikacji kolonii wytwarzających inhibitory β-laktamaz wykorzystuje się chromogen nitrocefinę (półsyntetyczna cefalosporyna) o barwie żółtej. W wyniku dyfuzji inhibitora i jego reakcji z enzymem, całość pokrywa się drugą warstwą agaru, zawierającą nitrocefinę.
• Po określonym czasie inkubacji wokół hodowli wytwarzającej inhibitory β-laktamaz zostaje zachowana niezmieniona strefa barwy żółtej, podczas gdy reszta płytki w wyniku rozkładu nitrocefiny zmienia kolor na czerwony.
• Często powstający produkt biotransformacji jest dalej metabolizowany, co uniemożliwia jego otrzymanie w większej ilości w podłożu. Zmodyfikowaną technikę wzbogaconych auksotrofów wykorzystuje się do selekcji mutantów z blokiem metabolicznym, niezdolnych do metabolizmu produktów biotransformacji.
Mutanty posiadające blok w różnych etapach szlaku metabolicznego akumulują produkty pośrednie w podłożach hodowlanych.
• Metoda ta wymaga indukcji i selekcji specyficznie blokowanych mutantów. W połączeniu z techniką wzbogacania mutantów, użycie takich form jest doskonałym narzędziem do uzyskania produktów biotransformacji.
• Alternatywną możliwość testowania kultur wytwarzających aminokwasy, witaminy lub antybiotyki stwarza tzw. metoda krążków agarowych polegająca na hodowli płytkowej testowanych kolonii na podłożu agarowym, z którego wycina się sterylnie krążki podłoża z testowanymi koloniami.
• Wycięte krążki nanosi się na płytki z drobnoustrojem testowym, inkubuje się w ciągu określonego czasu i mierzy strefy wzrostu jego kolonii wokół krążków ze szczepami wytwarzającymi aminokwasy czy witaminy lub zahamowania wzrostu wokół krążków z kulturami wytwarzającymi antybiotyki.
• W przypadku enzymów hydrolitycznych duże znaczenie mają testy płytkowe, opracowane przez Dinglera i WSP., które później były sukcesywnie rozwijane i odpowiednio modyfikowane przez innych autorów. Technika płytkowa polega na wprowadzeniu odpowiedniego substratu do zbuforowanego agaru, który wylewa się na płytki Petriego w warstwie o wysokości 4 mm.
• Po zastygnięciu agaru wycina się w nim studzienki o określonej średnicy i napełnia testowanym roztworem enzymu lub przesączami pohodowlanymi badanych mutantów. Płytki inkubuje się najczęściej w temp. 37oC w ciągu 18 godzin w celu uaktywnienia dyfuzji enzymu do agaru, po czym wybarwia się je odpowiednim czynnikiem wywołującym.
• Najczęściej testy te opierają się na wykorzystywaniu zjawiska dyfuzji pozakomórkowych produktów metabolizmu w podłożu agarowym i określeniu wielkości powstających stref przenikania, ujawnianych najczęściej przy użyciu odpowiednich wskaźników, specyficznych wywoływaczy lub drobnoustrojów testowych.
• Wielkość średnicy powstających stref jest miarą aktywności badanego szczepu. Testy te są wykorzystywane na drugim etapie selekcji, kiedy oceniane są aktywności metaboliczne kultur wyrosłych w podłożach płynnych.
• W ostatnim okresie opracowano wiele nowych metod skriningu leków przeciw chorobom infekcyjnym (przeciwnowotworowych, przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybowych) opartych na poszukiwaniu antymetabolitów oraz inhibitorów syntezy białka, RNA i DNA.
• Leków przeciwnowotworowych poszukuje się wśród inhibitorów enzymów wirusowych – neuramidazy i hialuronidazy oraz antymetabolitów.
• Z kolei leków przeciwgrzybowych oraz środków owadobójczych poszukuje się wśród inhibitorów syntezy chityny. Nowe testy selekcyjne umożliwiające identyfikację metabolitów o różnorodnej aktywności farmakologicznej, oparte są na wykrywaniu inhibitorów określonych enzymów, jak również mających zdolność wiązania się z określonymi strukturami subkomórkowymi. Wśród nich mogą znaleźć się potencjalne leki przeciwnowotworowe, do których należą antymetabolity, zwłaszcza analogi strukturalne zasad purynowych i pirymidynowych. Z uwagi na ich wysoką aktywność przeciwbakteryjną w podłożach minimalnych, selekcja tych antymetabolitów jest znacznie ułatwiona.
• Substancje wykazujące zdolność do wiązania się z receptorami powierzchniowymi, mogą oddziaływać na układ immunologiczny człowieka i zwierząt. Należą do nich enzymy takie jak: ATPaza K+/Na+, alkaliczna fosfataza, aminopeptydazy czy esteraza, które są zlokalizowane na powierzchni komórek.
• Stwierdzono, że inhibitory tych enzymów izolowane z hodowli drobnoustrojów posiadają działanie immunosupresyjne lub immunostymulacyjne. Liczne z nich wykazują również aktywność przeciwnowotworową.
• Dotychczas opracowane metody wstępnego różnicowania aktywności metabolicznych drobnoustrojów są wystarczająco czułe podczas selekcji kultur izolowanych ze środowiska naturalnego lub mutantów w początkowym etapie ich doskonalenia, kiedy wielkość stref wzrostu lub jego zahamowania jest niewielka (ok. 20 mm)
• Jednak w procesie selekcji wysokoaktywnych mutantów są mniej przydatne z uwagi na mniejsze zróżnicowanie wielkości ich średnic.
• Możliwość zwiększenia czułości tych metod polega na zmniejszeniu grubości warstwy podłoża testowego, zmianie stężenia substratu lub czynnika chromogennego, wartości pH, temp. reakcji itp.

HODOWLA WZBOGACAJĄCA
• Metoda ta opiera się na wprowadzeniu do próbki pobranej ze środowiska związków chemicznych mogących pełnić rolę czynnika selekcyjnego, pozwalającego na zmiany liczebności mikroorganizmów tworzących populację drobnoustrojów zawartych w badanej próbce, podczas jej inkubacji w określonych warunkach fizykochemicznych, tj. temperatura, czas inkubacji.
• Hodowla wzbogacająca z zastosowaniem podłoży wzbogacających
Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu produkującego nowy antybiotyk

A – zastosowanie folii półprzepuszczalnej; B – zastosowanie podwójnych płytek z przegrodą półprzepuszczalną; C – metoda bloczków agarowych

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu produkującego inhibitor enzymu rozkładającego antybiotyk

Metoda bloczków agarowych połączona z użyciem wskaźnika barwnego
Nitrocefina – substrat β-laktamazy, półsyntetyczna cefalosporyna
PRZECHOWYWANIE DROBNOUSTROJÓW PRZEMYSŁOWYCH
• Istotnym czynnikiem pozwalającym na prowadzenie powtarzalnych procesów biotechnologicznych jest zabezpieczenie czystości mikrobiologicznej i maksymalnej żywotności drobnoustrojów przemysłowych, a przede wszystkim zaś zachowanie pożądanych cech technologicznych.
• Najprostszym sposobem zabezpieczania aktywności metabolicznych drobnoustrojów przemysłowych jest przechowywanie ich w stanie wysuszenia. Ten sposób utrwalania jest najbardziej zbliżony do warunków występujących okresowo w naturalnym środowisku bytowania wielu drobnoustrojów saprofitycznych.
• Wygodną jego formą jest suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym. Metodę tę z powodzeniem stosuje się w przypadku obficie zarodnikujących grzybów strzępkowych. Hodowlę na skosie pozostawia się w temperaturze pokojowej aż do całkowitego wysuszenia zarówno podłoża jak i grzybni.
• Suszenie można także prowadzić pod próżnią w eksykatorze z umieszczoną w nim substancją higroskopijną (P2O3)
• Uzyskane w ten sposób suche konidia mogą utrzymać wysoką żywotność nawet w ciągu kilku lat.
• Często do suszenia zawiesin drobnoustrojów używa się odpowiednich nośników takich jak: piasek kwarcowy, kulki lub pierścienie szklane. Nośniki po przemyciu wprowadza się do probówek, które po sterylizacji (121oC w 30 min) suszy się w 25oC. Zawiesinę drobnoustrojów w odpowiednim roztworze ochronnym nanosie się na ten materiał i poddaje suszeniu w eksykatorze pod próżnią.
• Utrwalone w taki sposób kultury drobnoustrojów przechowywane w temperaturze 4oC bez dostępu wilgoci mogą zachowywać żywotność w dłuższym okresie czasu.
• Można znaczeni przedłużyć czas przechowywania tak przygotowanych kultur, jeśli spowolni się procesy metaboliczne zachodzące w drobnoustrojach odcinając dostęp tlenu przez zalanie skosów płynną sterylną parafiną. Na podobnej zasadzie można przechowywać drobnoustroje (bakterie, grzyby zarodnikujące) z wykorzystaniem piaski. W tym celu 1ml gęstej suspensji spor danego szczepu dodaje się do 5g sterylnego suchego piasku kwarcowego. Po wymieszaniu w probówce zamkniętej korkiem z waty suszy się całość w temperaturze 25oC. Utrwalone w ten sposób kultury można ożywić przez aseptyczne przeniesienie małej ilości piasku na powierzchnię odpowiedniego podłoża.
• Często stosowaną metodą jest suszenie w obecności silikażelu i substancji pochłaniających wilgoć (CaCl2). W tym celu do sterylnych probówek zawierających szklane lub porcelanowe perełki nanosi się kroplami suspensję komórek bakteryjnych w 1-2 ml 20% odtłuszczonego mleka. Po dokładnym wymieszaniu zawartości probówek przenosi się je na powierzchnię waty szklanej umieszczonej w probówce z silikażelem. Po ich wysuszeniu w temperaturze pokojowej przetrzymuje się je w zamkniętych pojemnikach w temperaturze 4oC.
• Powszechnie stosowaną metodą przechowywania drobnoustrojów jest zamrażanie w niskich temperaturach poprzez zamrażanie w ciekłym azocie (-196oC). Metoda ta wymaga odpowiedniego przygotowania drobnoustrojów, które polega na oddzieleniu ich podłoża wzrostowego i zawieszenia w roztworze ochronnym, a następnie zamrożeniu.
• Dodatek substancji ochronnych do utrwalonej kultury pozwala na uzyskanie korzystniejszych wyników.
• Stosowane są w tym celu naturalne płyny o charakterze białkowym (surowica krwi, odtłuszczone mleko, bulion, roztwór żelatyny) lub węglowodanowych (miód pszczeli, roztwór sacharozy, glukozy, laktozy, dekstranu) Można stosować również roztwory aminokwasów, takich jak kwas asparaginowy, glutaminian sodu lub 10% roztwór glicerolu i 5% roztwór dimetylosulfotlenku (DMSO). W procesie zamrażania bardzo istotna jest szybkość zamrażania prób. Stosuje się albo wolne tempo zamrażania z szybkością ok. 1oC/min albo bardzo szybkie – 100-1000oC/min. Temperatura przechowywania powinna być niższa od -20oC.
• Zamrażanie w ultra niskiej temperaturze od -60 do -80oC, którą uzyskuje się w specjalnych zamrażarkach mechanicznych lub przy wykorzystaniu ciekłego azotu w temperaturze od -156 do -196oC, zalicza się do nowszych metod utrwalania cech biotechnologicznych drobnoustrojów.
• Przed mrożeniem przygotowuje się populację komórek lub wielokomórkową tkankę przez hodowlę przy wielokomórkową tkankę przez hodowlę przy zwiększonym ciśnieniu osmotycznym w obecności podwyższonych stężeń cukrów oraz alkoholi polihydroksylowych takich jak mannitol, ksylitol, erytrytol, glicerol.

• Suszenie czystych kultur drobnoustrojów na perełkach szklanych
• Zamrażanie drobnoustrojów zaadsorbowanych na perełkach szklanych
• Zamrażanie kultur drożdży lub grzybów nitkowatych

• Korzystne jest stosowanie pożywki o składzie: 3% mannitolu, 1 M sorbitolu, 5% DMSO, 10% proliny i 7,5x10-5 kwasu abscysynowego. Powoduje to akumulację w komórkach niskocząsteczkowych substancji takich jak prolina, walina i glicyna, które mają działanie krioochronne w wyniku obniżenia temperatury zamarzania wody oraz chronią biopolimery (kwasy nukleinowe i enzymy) przed uszkodzeniami.
• Uzyskane w hodowli adaptacyjnej komórki odwirowuje się, zawiesza w specjalnej mieszaninie krioochronnej a następnie umieszcza w zamykanych polipropylenowych probówkach. W wyniku zamrażania komórek zawarta w nich woda przechodzi w formę kryształów, zaś substancje rozpuszczone w cytosolu ulegają szybkiemu zagęszczeniu. Może to doprowadzić do denaturacji białek. Na znaczne ograniczenie tego niekorzystnego zjawiska pozwala dodatek substancji ochronnych.
• Zastosowanie substancji osmogennych charakteryzujących się łatwością wnikania do komórek (glicerol, glikol propylenowy oraz DMSO) oraz zdolnością do wytwarzania wysokiego ciśnienia osmotycznego bez wnikania do wnętrza komórek przyczynia się do powolnego ich odwodnienia (cukry, dekstran, sorbitol, mannitol, ksylitol, glikol polietylenowy i inne). Do zamrażania komórek stosuje się zarówno sposoby z użyciem pojedynczego czynnika ochronnego lub ich mieszaniny.
• W czasie zamrażania ważna jest kontrola tempa tego procesu. Korzystne jest zapewnienie warunków sprzyjających tworzeniu dużej liczby małych kryształów lodu, gdyż w przeciwnym wypadku może dojść do rozrywania ścian komórkowych. W tym celu ampułki zawierające kultury w roztworze z gliceryną umieszcza się w metalowych pojemnikach, które wstawia się do zamrażarki z kontrolowanym tempem zamrażania (1-2oC/min), dopóki nie uzyska się temperatury kilka stopni powyżej punktu zmiany faz (ok. -30oC). Szybkie uzyskanie tej granicy osiąga się w komorze z ciekłym azotem.
• Po przekroczeniu tej temperatury zmniejsza się tempo dalszego ochładzania do 1oC/min i kontynuuje zamrażanie aż temperatura osiągnie wartość -50oC. Utrwalone w ten sposób kultury przechowuje się w zamrażarce z ciekłym azotem w temperaturze od -156 do -196oC.
• Decydującą rolę w zachowaniu żywotności zamrożonych komórek odgrywa przede wszystkim sposób rozmrażania. Powinien on przebiegać możliwie szynko, aby uniknąć wtórnego rozrastania się kryształów lodu i zniszczenia komórek.
• Nie stwierdzono dużych różnic w przeżywalności drobnoustrojów w zależności od temperatury ich przetrzymywania: -70oC (w zamrażarkach mechanicznych) czy -196oC (w ciekłym azocie)
• W procesie tym dochodzi jednak do znacznego spadku przeżywalności komórek w granicach od 80 do 90% (po kilku miesiącach czy nawet kilkuletnim przechowywaniu). Straty te można znacznie zmniejszyć przez właściwy dobór warunków krioprezerwacji.
• Liofilizacja należy do najbardziej efektywnych metod długotrwałego przechowywania drobnoustrojów zarówno w zakładach przemysłowych jak i dużych kolekcjach centralnych. Metoda ta wymaga specjalnego urządzenia z pompą próżniową pozwalającą na uzyskanie próżni rzędu 10-3 – 10-4 Tr oraz elementu umożliwiającego zamknięcie buteleczek z liofilizowanym materiałem w warunkach próżniowych.
• Proces liofilizacji jest zabiegiem drastycznym, powodującym znaczny spadek przeżywalności. Dobór właściwego roztworu ochronnego i użycie liofilizacji drobnoustrojów z wczesnej fazy stacjonarnej pozwala na zachowanie kilkuprocentowej przeżywalności oraz wydłużenie czasy przechowywania do kilkunastu lat. Metoda ta posiada jednak szereg niedogodności. Należy do nich: duży efekt letalny, możliwość powstawania mutacji oraz konieczność stosowania kosztownej aparatury.
• W procesie liofilizacji wyróżnia się dwa etapy: w pierwszym z nich zawiesinę komórek rozlaną po ok. 0,5ml do szklanych fiolek poddaje się zamrażaniu, w drugim zaś w warunkach podciśnienia (10-3 – 10-4 Tr) następuje sublimacja wody. Korzystne jest powolne mrożenie, w tempie ok. 1oC/min lub bardzo szybkie wynoszące ok 1000oC/min. Z uwagi na efekt toksyczny tlenu w stosunku do komórek należy maksymalnie ograniczyć jego dostęp. Umożliwia to szybkie prowadzenie wszystkich operacji pomiędzy etapem zamrażania a sublimacją. Probówki poddane liofilizacji zatapia się „pod próżnia”.
• Istnieje możliwość długotrwałego przechowywania komórek z zachowaniem ich żywotności i cech technologicznych, jeśli wewnątrz zatopionych probówek jest próżnia oraz zawartość wody nie przekracza 1%. Utrwalone metodą liofilizacji kultury należy przechowywać w pomieszczeniu o temperaturze poniżej 5oC.
• W długotrwałym przechowywaniu szczepów liofilizowanych wskazane jest ich przetrzymywanie w zamrażarkach w temperaturze od -20 do -70oC.
• W większości przypadków proces liofilizacji nie wpływa ujemnie na właściwości biotechnologiczne zabezpieczonych drobnoustrojów. Warto mieć na uwadze, iż w czasie liofilizacji może wystąpić negatywna selekcja, gdyż nie zawsze najbardziej żywotne komórki muszą charakteryzować się pożądanymi cechami technologicznymi. W celu zminimalizowania niekorzystnego oddziaływania procesu na komórki drobnoustrojów wskazane jest użycie zawiesiny komórek o dużej gęstości w obecności czynników ochronnych takich jak: glicerol (10% v/v), dimetylosulfotlenek (DMSO) w st. 5%, surowica końska, odtłuszczone mleko (20g/100ml), sacharoza (12g/100ml) a także roztwory innych cukrów (dekstranu, glutaminian sodu))

CZYNNIKI FIZJOLOGICZNE WPŁYWAJĄCE NA NADPRODUKCJĘ METABOLITÓW WYTWARZANYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE
• Istotny wpływ (oprócz aktywności szczepów) na syntez określonych metabolitów wywierają też określone warunki środowiskowe, takie jak skład podłoża, jego wartość pH, temperatura oraz sposób hodowli i czas jej trwania.
• Właściwy dobór tych czynników umożliwia uzyskanie określonych produktów o wydajności, która decyduje o prowadzeniu biosyntezy w szerszej skali.

WYKŁAD 4 – 8 MARCA:
Pożywka – podstawowy czynnik wpływający na procesy wytwarzania określonych produktów przez drobnoustroje; oddziałuje ona na wzrost drobn., w ten sposób zwiększa lub zmniejsza ilość biomasy i produktu biosyntezy lub też może wywierać sprzyjający wpływ na ich powstawanie.
W procesach biotechnologicznych mogą być wykorzystywane pożywki ciekłe i stałe.
Pożywki ciekłe:
– składniki mineralne w porcjach ustalonych empirycznie uzależnione od wymagań drobn. W skład pożywek organicznych heterotroficznych wchodzą substancje organiczne i mineralne.
Rodzaj subst. wykorzystywanych z podłoża i ich stężenie w pożywce zależą od rodzaju, gatunku drobn. i ich wykorzystania (biomasy, metabolity).
Zmiana składu pożywki często może spowodować zmianę kierunku metabolizmu kom.. Przykładem tego może być grzyb nitkowaty A. niger, który przy zróżnicowaniu składu pożywki i warunków biosyntezy potrafi syntetyzować całą gamę metabolitów w stosunkowo dużych stężeniach.
Uzyskanie max. wydajności biomasy komórkowej nie zawsze jest skorelowane z max. wydajnością określonego metabolitu.
Podział pożywek w zależności od stanu skupienia:
- stałe (w postaci past),
- ciekłe.
… ze względu na pochodzenie i skład chem:
- organiczne (naturalne i syntetyczne),
- mineralne.
… ze względu na stan wzajemnego wymieszania składników pożywki ciekłe dzielą się na:
- roztwory rzeczywiste,
- r-ry koloidalne,
-zawiesiny,
- emulsje (np. n-alkany)
Od rodzaju pożywki uzależnionych jest wiele elementów eksploatacyjnych i technologicznych danego procesu technologicznego.
Roztwory pożywek często tworzą układ cieczy nieniutonowskiej, co stwarza wiele problemów podczas kontrolowania i obliczania niektórych parametrów technologicznych procesu, np. stopnia natlenienia, współczynnika przenoszenia tlenu lub mocy mieszania.
W skład najczęściej stosowanych pożywek ciekłych wchodzą produkty naturalne: mleko, serwatka otręby pszenne, wytłoki buraczane, mąka kukurydziana, wyciągi wodne z surowców naturalnych (brzeczka), wyciąg z mąki sojowej i kukurydzianej, bulion, kiełki słodowe, wytłoki jabłkowe i winogronowe, trzciny, melasa, ługi posulfitowe, n-alkany.
W procesach oczyszczania metodami biologicznymi następuje intensywny przyrost biomasy (osadu czynnego lub błony biologicznej). Wykorzystuje się tutaj ścieki przemysłowe (szczególnie przemysłu spożywczego, które również można uważać za pożywkę)
Pożywki stosowane w hodowlach komórkowych i tkankowych są szczególnie złożone pod względem składu chemicznego.
Część rozbieżności dotycząca wpływu składu pożywek da się wytłumaczyć zastosowaniem do badań różnych gatunków drobnoustrojów, zmiennymi warunkami hodowli oraz zastosowaniem do pożywek surowców o niezbyt ściśle określonym składzie chemicznym.
Składnikami podłoża stałego są najczęściej odpady stałe przemysłu spożywczego: otręby pszenne, plewy, wytłoki buraczane, mąka kukurydziana, kiełki słodowe, trociny, rozdrobnione ziemniaki paszowe.
Z uwagi na wymagany skład chemiczny podłoże stałe i ciekłe wymagają zrównoważenia ilościowego podstawowych składników (węgla, azotu, fosforu), a także wzbogacenia w makro- i mikroelementy, witaminy i inne bliżej nieokreślone substancje o działaniu oligodynamicznym.
Istotny wpływ na przebieg metabolizmu mikroorganizmów w niektórych procesach technologicznych mają induktory, prekursory lub inhibitory. Przykładem może być dodatek wodorosiarczanu(IV) sodu (NaHSO3) do podłoża w procesie fermentacji amonowej przy zmianie errozony (?) pozwalający na zwiększenie wydajności glicerolu w wyniku blokowania aldehydu octowego jako akceptora wodoru. Jego brak powoduje skierowanie metabolizmu na wytwarzanie glicerolu.
W procesie fermentacji glukonowej przy użyciu A. niger w warunkach stabilizacji pH przy użyciu węglanu wapnia na poziomie pH 5-6,5 fermentacja przebiega w kierunku wytworzenia kwasu glukonowego z uwagi na stabilność oksydazy glukozowej przy tych wartościach pH. Niska wartość pH podłoża powoduje zahamowanie wytwarzania kwasu glukonowego i zwiększenie wydajności kwasu cytrynowego.
Jako podłoży hodowlanych w badaniach laboratoryjnych stosuje się pożywki syntetyczne sporządzone z czystych substancji i pożywki kompleksowe zawierające produkty pochodzenia naturalnego (hydrolizaty białkowe, ekstrakt drożdżowy).
Nie zawsze podłoża stosowane w badaniach laboratoryjnych są odpowiednie do hodowli w warunkach przemysłowych.
Podłoża do hodowli przemysłowych – warunki:
- max wydajność produktu lub biomasy,
- duża szybkość wytwarzania produktu,
- niska cena i dostępność przez cały rok,
- brak lub min zawartość niepożądanych produktów,
- minimalizacja trudności technologicznych (napowietrzanie, mieszanie, oczyszczanie produktu, wytwarzane ścieków i odpadów).
W technologiach produktów wytwarzanych w dużych ilościach, np. etanol czy biomasa drożdży do celów paszowych, koszty surowca stanowią 50-70% kosztów eksploatacyjnych. Ważne znaczenie dla tych technologii ma cena surowców na rynku lokalnym.
Proces sterylizacji podłoży często może wpływać negatywnie na ich właściwości. Z tego powodu zaleca się oddzielną sterylizację roztworów cukrów, aby uniknąć w podwyższonej temperaturze niepożądanych reakcji.
Zgodnie z teorią Finka (odnosi się do procesu nagromadzenia biomasy drożdży):
1/3 węgla zawartego w podłożu jest zużywana na procesy energetyczne, a 2/3 ilości węgla – na przyrost biomasy. W biomasie drożdży zawartość C:P:N wynosi 6:1:0,2 i takie proporcje powinny być zachowane w podłożu.
Prawo minimum Liebiga – rozwój organizmów ogranicza ten czynnik, który pierwszy wystąpi w ilości minimalnej (krytycznej) -> „czynnik minimum”
Prawo tolerancji Shelforda – określa wytrzymałość org. na nadmiar jakiegoś czynnika, powyżej którego jest niemożliwy ich rozwój.
Nieodpowiedni dobór składu podłoża, wartości pH, niedostosowany do potrzeb namnażania drobn. dobór substratu powoduje, że składniki zostaną wykorzystane do poziomu „minimum”, pozostałe zaś nie zostaną wykorzystane.
Wytwarzanie metabolitów jest ściśle uzależnione od odpowiedniego poziomu stężenia jonów wodorowych środowiska naturalnego. W wielu procesach kontrola i stabilizacja pH ma bardzo istotne znaczenie. Korygowania kwasowości pożywki w czasie fermentacji dokonuje się najczęściej automatycznie przez dozowanie roztworów zasad, kwasów, glukozy lub świeżej sterylnej pożywki za pomocą pH-statu.
Podobną rolę może pełnić dodatek do niektórych pożywek specjalnych czynników buforujących, np. węglan wapnia, fosforany pozwalające utrzymać odczyn obojętny podłoża.
W wyniku metabolizmu drobnoustrojów w podłożu na skutek preferencyjnego wykorzystania określonych kationów lub anionów może zachodzić zakwaszenie lub alkalizacja roztworu, np. obecność w podłożu soli amonowych jako źródła azotu, zużycie kationu amonowego prowadzi do zakwaszenia roztworu, zaś w przypadku wykorzystania azotanów obserwuje się jego alkalizację.
Kiedy zaś składnikiem podłoża jest azotan amonu w pierwszej fazie następuje zakwaszenie roztworu w wyniku preferencyjnego asymilowania jonu amonowego. W drugiej fazie (po wyczerpaniu jonu amonowego) następuje wykorzystanie azotanu jako alternatywnego źródła azotu i zwiększenie pH roztworu. Efekt hamowania asymilacji azotanów jest związany z tym, że reduktaza azotanowa, podstawowy enzym uczestniczący w przemianie azotanów w jon amonowy, jest represjonowany.
O aktywności procesu technologicznego decyduje w dużej mierze opracowanie podłoża hodowlanego, którego skład wpływa na wzrost org., jego biomasę, wydajność bioproduktów i in. Właściwie opracowane podłoże może znacznie obniżyć koszty procesu.
Największe efekty można osiągnąć przez połączenie opracowywania pożywki i skriningu. Takie skoordynowane opracowanie zmniejsza możliwość przeoczenia efektywnie pracującego układu.
Dobór pożywki – zasada eliminacji lub uzupełnienia jej zestawu określonymi składnikami i ustalaniu ich optymalnego poziomu, bądź przy pomocy metod matematycznych.
Optymalne podłoże zawiera odpowiednie źródło węgla, azotu, fosforu, siarki, potasu i mikroelementów, które umożliwiają optymalny wzrost, ale i wpływają korzystnie na wzrost biomasy oraz ułatwiają uzyskanie produktu o dużej czystości i wydajności.
Podczas doboru należy uwzględnić:
- koszty używanych surowców,
- ewentualne reakcje precypitacji,
- jakość wody,
- rozpuszczalność związków stałych,
- wpływ składników pożywki na stosowane techniki i na oczyszczanie produktu.
Ułatwia to projektowanie składu podłoży na skalę przemysłową, która mogłaby być stosowana równie efektywnie dla różnych drobnoustrojów.
W doskonaleniu i selekcji szczepów można użyć optymalnego podłoża, opracowanego dla jednego szczepu. Istnieje też możliwość wykorzystania niezmodyfikowanego podłoża i późniejsze ulepszanie jego składników dla najlepszego szczepu. Opracowanie należy rozpocząć od określenia cech.
Strategie doboru podłoża:
- strategia zamknięta – opiera się na ustaleniu optymalnych proporcji wybranych wcześniej składników podłoża. Przyjmuje ona, że eksperymentator dysponuje najlepszymi dostępnymi składnikami i dlatego nie uwzględnia pozostałych, które również teoretycznie mogłyby okazać się korzystne.
- strategia otwarta – nie zakłada z góry wyboru określonych składników, lecz poszukuje najbardziej korzystnej kombinacji wszystkich dostępnych związków. Jest to więc metoda bardziej kompleksowa, ale z drugiej strony bardzo czasochłonna i trudniejsza do zaplanowania i zrealizowania.
Dobór nie może być całkowicie przypadkowy.

KWAS OCTOWY
Procesy utleniania niecałkowitego – fermentacje utleniające (oksydatywne)
- procesy fermentacyjne przebiegające w warunkach tlenowych, w wyniku których powstają częściowe utlenione związki organiczne wydalane na zewnątrz komórki, np. kwas octowy, glukonowy, cytrynowy, fumarowy, bursztynowy – produkty końcowe.
Pojęcie „fermentacja” ma znaczenie raczej technologiczne niż czysto teoretyczne w rozumieniu biochemicznym (fermentacja – podobieństwo do procesów beztlenowych i fermentory).
Pod pojęciem utleniania całkowitego rozumie się fakt, że w wyniku procesów oddechowych nie zostaje wydalony z komórek żaden związek organiczny, gdyż org. związki pokarmowe zostają utlenione max do CO2 i H2O.
Mikroorganizmy w wyniku fermentacji utleniających uzyskują większą ilość energii niż w przypadku klasycznej fermentacji, jednak o wiele mniejszą niż w przypadku oddychania tlenowego.
Fermentacja octowa – proces biochemicznego utleniania etanolu do kwasu octowego wg schematu:
C2H5OH + NAD dehydrogenaza etanolu CH3CHO + NADH2
CH3CHO + NAD + H2O dehydrogenaza aldehydu octowego CH3COOH + NADH2
C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 118 kcal
Niektóre bakterie octowe (peroksydanty) mają zdolność dalszego utleniania kwasu octowego:
CH3COOH + 2O2 2CO2¬ + H2O
Utlenianie etanolu do kwasu octowego to proces dwuetapowy z udziałem tlenu:
• I etap: utlenienie aldehydu etylowego do aldehydu octowego przez dehydrogenazę alkoholową sprzężoną z cytochromem 553.
• II etap: utlenienie aldehydu do kwasu octowego przy udziale dehydrogenazy aldehydowej współdziałającej z cytochromem 553 lub sprzężonej z NADP+.
Enzymy są zlokalizowane na zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej komórki.

BAKTERIE OCTOWE:
- rodzaj Acetobacter (urzęsiona perytrychalnie) lub Gluconobacter (Acetomonas, urzęsione polarnie),
- w naturze występują głównie na roślinach i w sokach zawierających cukry w towarzystwie drożdży,
- mało ruchliwe pomimo urzęsienia,
- kształt krótkich pałeczek, mogą występować pojedynczo, po dwie lub w łańcuszkach.
- duża zmienność morfologiczna, tworzą formy inwolucyjne o nieznanym znaczeniu.
- ścisłe tlenowce – na powierzchni pożywki tworzą kożuszek zbudowany z komórek zawieszonych na włókienkach celulozy,
- zdolność utleniania alkoholu etylowego do kwasu octowego,
- zdoln. utl. innych alkoholi pierwszorzędowych do odpowiednich kwasów tłuszczowych i alkoholi drugorzędowych do odpowiednich ketonów.
- mezofile,
- rozmnażanie: podział poprzeczny,
- nie wytwarzają przetrwalników,
- młode komórki barwią się G-, starsze – zmiennie.
Podział bakterii octowych:
 suboksydanty – nie utleniają nagromadzonego kwasu octowego (np. Acetobacter schutzenbachii, A. orleanense, A, xylinoides, A. vini acetah, Acetomonas suboksydans),
 peroksydanty – przy wyższym stężeniu etanolu wytwarzają kwas octowy, a gdy stężenie etanolu spada zaczynają utleniać nagromadzony kwas do CO2 i H2O (np. Acetobacter peroxydans, Acetobacter rancens),
 mezooksydanty – utleniają kwas octowy bardzo powoli (np. Acetobacter xylinum, A. aceti, A. acidphilum). Niekiedy nie wyróżnia się osobno tej grupy, wówczas jej przedstawicieli zalicza się do per oksydantów.
Gluconobacter:
Nie dysponują kompletem enzymów cyklu Krebsa, nie mogą utleniać kw. octowego do CO2 (suboksydanty). Są bardziej rozpowszechnione w środowisku naturalnym niż Acetobacter (wykorzystują sacharydy z kwiatów, miodu, owoców, soków i moszczów, powodując ich psucie się). Powodują straty w plonach jabłek i gruszek rzędu 20%. Są trudne do izolacji ze względu na towarzyszącą im mikroflorę zaadaptowaną do znacznej kwasowości i wysokiego stężenia cukrów i etanolu.
Metabolizm bakterii octowych:
- do syntezy kwasu octowego wykorzystują: etanol, proste alkohole, sacharydy (glukoza, fruktoza), ich pochodne (mannitol).
- metabolizm heksoz w cyklu pentozowym (HMP) oraz glukoneogenezie (służy do syntezy glukozy – nie jest odwróceniem glikolizy),
- nie mają fosfofruktokinazy,
- nie mogą prowadzić przemian szlaku EMP,
- zastosowanie: przemysł spożywczy: fermentacja octowa (ocet: 6-10% roztwór kwasu octowego), produkcja tworzyw sztucznych – jedwab sztuczny, barwniki, substancje zapachowe (estry), rozpuszczalniki, leki (np. aspiryna).
- działanie niekorzystne: psucie się soków owocowych, uszkodzonych owoców jagodowych, szkodniki w przemyśle winiarskim i browarskim – zmętnienie i zmiany smakowo-zapachowe, zakażają produkty mleczarskie, ciasta, galaretki, przetwory owocowe, marynaty warzywne.

WYKŁAD 5
Znaczenie bakterii octowych:
Zastosowanie: fermentacja octowa, w której wykorzystuje się bakterie fermentacji octowej jest
podstawowym procesem w przemysłowej produkcji octu. Ocet to 6-10% r-r kwasy octowego
wykorzystywany do celów spożywczych. Kwas octowy jest też używany do produkcji tworzyw
sztucznych np. jedwabiu sztucznego, barwników, substancji zapachowych (estrów),
rozpuszczalników, leków np. aspiryny.
Działanie niekorzystne: bakterie octowe powodują psucie soków owocowych oraz uszkodzonych
owoców jagodowych oraz są szkodnikami w przemyśle winiarskim i browarnictwie wywołując
zmętnienie oraz zmiany smakowo – zapachowe. Mogą takę zakażać produkty mleczarskie, cista,
galaretki, przetwory owocowe, marynaty warzywne.

Metody otrzymywania octu:
Metoda orleańska – tradycyjna, wolno przebiegająca (kilka tygodni) metoda wytwarzania octu
z wina (rzadziej piwa), leżakującego w poziomo ułożonych beczkach. Na powierzchni płynu tworzy
się błona zawierająca bakteria octowe, niekiedy wzmacnia się ją rusztowaniem z cienkich listewek
lub trzciny. Wino poddawane przerobami na ocet miesza się z niewielka ilością świeżego octu w
takiej proporcji, że do 2/3 wina dodaje się 1/3 octu gotowego, zawierającego żywe bakterie octowe.

Metoda szybkiego octowania ( Schűtzenbacha) – wykorzystuje bakterie octowe osadzone na
wiórach bukowych umieszczonych specjalnych kadziach (twornikach) (5-10 m3), do których od
góry wprowadza się 10 – 12% roztwór etanoli z dodatkiem kwasu octowego (2%).
Napowietrzanie pożywki następuje w wyniku konwekcji naturalnej, z boku twornika zazwyczaj
znajduje się otwór zapewniający lepszą cyrkulację powietrza, W celu uzyskania octu
o odpowiedniej koncentracji zalewa jest zawracana wielokrotnie.

Metoda generatorowa – z wykorzystaniem generatora Fringsa – aparaty znacznie większe od tych
stosowanych w metodzie szybkiego octowania ( do 120cm3) wyposażonych w instalację tłoczącą
do srodka jałowe powietrze oraz instalację chłodzącą zapewniającą optymalną temperaturę 26 -28
st. C. Zwykle dla uzyskania odpowiedniej koncentracji kwasu octowego (ok. 6%) konieczne jest
przepuszczenie zalewy w generatorze Fringsa od 30 do 80 razy.

Metoda wgłębna – prowadzona w reaktorach zwanych acetatorami, Są to aparaty ze stali
kwasoodpornej zapewniające pełną sterylność i automatykę, umożliwiające uzyskanie najwyższej
produkcyjnej i wydajności procesu otrzymywania octu. Bakterie (w postaci czystych kultur) są tutaj
zawieszone w roztworze, który zawiera odpowiednią ilość alkoholu etylowego, przy czym roztwór
ten jest intensywnie napowietrzany.
Szybkość produkcji w tej metodzie wynosi do 40g kwasu octowego na dm3 w ciągu 24h. Jest ona
dziesięć razy większa aniżeli ma to miejsce w generatorach Fringsa i sto razy większa
w porównaniu z metodą orleańską.

Szkodniki octownictwa:
Bakterie z grupy peroksydantów i mezoksydantów, zwłaszcza Acetobacter xylinum. Jest to bakteria
utleniająca kwas octowy do CO2 i H2O, wytwarzająca ponadto znaczne ilości, śluzu. Na skutek
tego powoduje w krótkim czasie odcinanie bakterii octowych osadzonych na wiórach bukowych od
dostępu powietrza co obniża efektywność procesu wytwarzania octu.
Ilości śluzu, które tworzy ta bakteria, mogą być tak znaczne, że przechodzą do octu butelkowanego
i są tam widoczne w postaci koloidalnych osadów.

Węgorek octowy (Anguillila aceti), przedstwiciel nicieni ( Nematodes, robaki obłe). Jego
rozmiary dochodzą do 2,5 mm. Węgorki są żyworodne i rozmnażają się stosunkowo szybko.
W occie o mocy 3,5 – 6%, w ciągu 8 dni(!) samica może dać potomstwo złożone w 45 osobników
(CYRK NA KÓŁKACH :)) W occie o mocy 9-10% żyją długo, jednak pozbawione są zdolności
rozmnażania się. Węgorek nie przynosi żadnej szkody gotowemu octowi, ponieważ nie odżywia się
octem lecz bakteriami octowymi. Jednak obecność węgorka w gotowym occie wpływa ujemnie na
jego klarowność i nie jest akceptowana przez konsumentów, dlatego jest on usuwany na drodze
filtracji, Węgorki octowe towarzyszą fermantacji prowadzonej metodami powierzchniowym
i ociekowymi (występują m.in. w twornikach), zaś nie podczas prowadzenia fermantacji metodami
wgłębymi.
Do pośrednich szkodników octownictwa należą niektóre owady, tj. mus
2012-06-20
1 2012-06-20
<< Kwiecień 2014
PonWtŚrCzwPiąSobNie
123456
78910111213
14151617181920
21222324252627
282930
Księga gości
 
O mnie
mikrobiologiabio
Słówko o mnie
Zobacz mój profil
Zobacz serwisy INTERIA.PL